阿托伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的研究.pdf

1、第一部分:大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬模型的構(gòu)建及電鏡鑒定 目的：為研究阿托伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的影響，我們構(gòu)建了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬模型. 方法：貼塊法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法(S—P法)鑒定。血管內(nèi)皮細(xì)胞傳至第3代時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，換用3％胎牛血清(FBS)的DMEM液培養(yǎng)12h使細(xì)胞同步化。所選細(xì)胞換用20％FBS的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24h后，用PBS液洗滌3遍，加入與原培養(yǎng)基相

2、同體積的Hanks'液孵育30分鐘后收獲細(xì)胞。將得到的細(xì)胞制作成電鏡標(biāo)本，觀察，攝片。 結(jié)果：1在倒置相差顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈扁平多角形，邊界清楚，胞質(zhì)豐富，核圓形或橢圓形，居中，偶見雙核，隨細(xì)胞密度增加呈現(xiàn)“鋪路石樣”排列。 2熒光顯微鏡下可見細(xì)胞胞漿內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達(dá)Ⅷ因子，符合內(nèi)皮細(xì)胞特征。 3經(jīng)透射電鏡觀測(cè)所構(gòu)建的細(xì)胞自噬模型，發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞中均出現(xiàn)包裹有未降解的胞漿物質(zhì)、細(xì)胞器的雙

3、層膜結(jié)構(gòu)，高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其為典型的自噬體結(jié)構(gòu)，自噬模型構(gòu)建成功。 結(jié)論：本研究結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行阿托伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分阿托伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的影響 目的：觀察不同時(shí)相使用阿托伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響，探討其保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的可能機(jī)制。 方法：采用Hanks’液替代培養(yǎng)基以饑餓誘導(dǎo)的方法，使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬。在誘導(dǎo)自噬前和誘導(dǎo)過程中，使細(xì)胞分別與含或

4、不含阿托伐他汀的正常培養(yǎng)基或Hanks'液共孵育，并隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Ⅰ組)、誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)中都應(yīng)用阿托伐他汀組(Ⅱ組)、僅在誘導(dǎo)中應(yīng)用阿托伐他汀組(Ⅲ組)和僅在誘導(dǎo)前應(yīng)用阿托伐他汀組(Ⅳ組)。應(yīng)用透射電鏡檢測(cè)各組細(xì)胞自噬的發(fā)生情況，RT—PCR技術(shù)檢測(cè)組間Beclin1和Mapllc3兩基因的表達(dá)。 結(jié)果：與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅲ組的Beclin1和Mapllc3兩基因mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)。Ⅳ組的表達(dá)低于Ⅰ組，無