阿托伐他汀和硒對SAA作用下血管內皮細胞功能的影響.pdf

1、炎癥在動脈粥樣硬化過程中起著至關重要的作用。內皮是機體血管的重要保護屏障，血管內皮功能狀態(tài)和結構完整性與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關。血管內皮具有阻止巨噬細胞浸潤和泡沫細胞形成及調節(jié)凝血、阻礙血栓形成的功能，從而防止動脈粥樣硬化發(fā)生。
　　 血清淀粉樣蛋白A（serumamyloidA，SAA）不僅是一種急性反應蛋白的生物標志，可能還是心血管疾病的危險因素。SAA能夠促進單核細胞趨化、黏附并且在動脈粥樣硬化斑塊處沉積。SAA

2、能夠增加高密度脂蛋白(HDL)對巨噬細胞和內皮細胞的親和力，通過清道夫受體B-I(SRB-I)影響高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的吸收，促進細胞HDL-C的代謝。然而，SAA在內皮功能中的作用和機制還不太清楚。
　　 本研究擬分為三部分來探討SAA對血管內皮細胞的影響機制及阿托伐他汀、硒的調節(jié)作用。
　　 第一部分：急性冠脈綜合征患者血清SAA、eNOS、HO-1和硒水平的比較
　　 目的：
　　 SA

3、A、eNOS、HO-1和硒對冠心病的保護性作用具有爭議，本研究目的是觀察急性冠脈綜合征患者血清SAA、eNOS、HO-1和硒的水平，探討發(fā)生ACS的發(fā)病機制和具有預測價值的炎性指標及可能的保護因素。
　　 方法：
　　 選擇90例ACS患者，其中急性心肌梗死42例（AMI組），不穩(wěn)定性心絞痛48例（UAP組）以及同期的穩(wěn)定型心絞痛41例（SAP組）和44例健康者(NC組)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定所有入選者血

4、清中SAA、eNOS、HO-1和硒水平。根據(jù)冠狀動脈造影結果計算Gensini積分，根據(jù)Gensini積分分為＜16分組、16～32分組和＞32分組。結合病程(duration)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白A1c(HbA1c)等臨床資料進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 1.AMI組、UAP組、

5、SAP組與NC組之間的年齡、性別無差異(P＞0.05)，SBP，DBP，TC，LDL-C和Gensini積分在AMI組、UAP組與SAP組、NC組比較均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);Gensini積分在AMI組明顯高于SAP組與NC組，比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，在AMI組、UAP組、SAP組與NC組分別為31.77±16.63，23.51±10.39，24.24±10.06和0。
　　 2.AMI組患者SAA水平最高

6、，UAP組次之，NC組SAA水平最低，兩兩比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）;AMI組、UAP組eNOS、HO-1水平顯著低于SAP組和NC組(P＜0.01);ACS組和SAP組的Se水平明顯低于NC組(P＜0.01)，AMI組、UAP組、SAP組三組之間Se水平雖有所不同但未達到顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。SAA水平在AMI組、UAP組、SAP組和NC組分別為16.27±2.49，14.74±3.10，6.99±4.7

7、8，2.01±0.79;eNOS水平在AMI組、UAP組、SAP組和NC組分別為6.14±0.77，7.10±1.32，8.59±1.26，14.50±3.74;HO-1水平在AMI組、UAP組、SAP組和NC組分別為33.98±2.47，39.07±3.30，46.76±4.97，53.41±3.92;Se水平在AMI組、UAP組、SAP組和NC組分別為64.73±6.86,66.92±6.70,64.36±6.15,79.81±7.

8、09。
　　 3.SAA水平隨著Gensini積分的增加而上升，組間兩兩比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;eNOS、HO-1水平隨著Gensini積分的增加而降低，＜16分組與16～32分組比較無統(tǒng)計學差異，其它各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Se水平在0分組最高，＜16分組、16～32分組、＞32分組與0分組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），其它各組間兩兩比較均無統(tǒng)計學意義。
　　 4.SAA與Gens

9、ini積分呈顯著正相關r=0.706，與eNOS、HO-1、硒水平呈顯著負相關，相關系數(shù)分別為r=-0.715、r=-0.828、r=-0.476;eNOS與Gensini積分呈顯著負相關r=-0.675，與HO-1、硒水平呈顯著正相關，相關系數(shù)分別為r=0.772、r=0.570;HO-1與Gensini積分呈顯著負相關r=-0.651，與硒水平呈顯著正相關，相關系數(shù)分別為r=0.520;硒水平與Gensini積分呈顯著負相關r=-0

10、.482。
　　 結論：
　　 1.高血壓、高血脂、高血糖是ACS發(fā)生的相關因素。
　　 2.ACS組SAA水平明顯升高，eNOS、HO-1和硒水平降低，提示SAA、eNOS、HO-1和硒均參與了ACS的發(fā)生和發(fā)展。
　　 3.SAA水平隨著Gensini積分的增加而上升，eNOS、HO-1及硒水平隨著Gensini積分的增加而下降，提示SAA、eNOS、HO-1及硒水平可能與病變嚴重程度相關，SAA水平

11、越高，eNOS、HO-1及硒水平越低，病變程度越嚴重。
　　 4.相關分析結果顯示SAA與eNOS、HO-1和硒水平呈負相關，提示高水平的SAA可能通過降低eNOS、HO-1這些細胞、血管的保護因子而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。
　　 第二部分：SAA對人臍靜脈內皮細胞作用和機制的探討
　　 目的：
　　 探討SAA對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical veinendothelial ce

12、lls，HUVECs)eNOS、HO-1、SelS分子表達和一氧化氮(NO)、總抗氧化能力(T-AOC)和活性氧簇(ROS)的影響。
　　 方法：
　　 HUVECs培養(yǎng)，待細胞融合至約70％左右時進行同步化處理后分組，分別在各組細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度SAA(0mg/L，1mg/L，10mg/L，20mg/L)，同時加入濃度為20mg/L的SAA分別作用于不同時間(0h，6h，12h，24h)后收獲細胞，提取總RNA，

13、通過實時熒光定量（RT-PCR）測定各組eNOSmRNA、HO-1mRNA和SelSmRNA轉錄水平;免疫印跡法(Western blotting)檢測SAA對各組eNOS，HO-1,SelS蛋白表達的影響;同時用MTT測定各組細胞活性，檢測細胞培養(yǎng)液中NO，T-AOC和ROS的含量并進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 1.通過RT-PCR結果顯示:SAA濃度為10mg/L，20mg/L作用于細胞24h后，可抑制eNO

14、SmRNA，HO-1mRNA，SelSmRNA的轉錄且呈現(xiàn)出濃度依賴性，在SAA濃度10mg/L時灰度值分別為（2.43±0.71），（1.87±0.33），（1.65±0.48），在SAA濃度20mg/L時灰度值分別為（1.54±0.51），（1.61±0.40），（1.33±0.45）;終濃度20mg/L的SAA作用于細胞0h，6h，12h，24h，均可抑制eNOSmRNA，HO-1mRNA，SelSmRNA的轉錄且呈現(xiàn)出時間依賴性

15、;20mg/L的SAA作用0h，6h，12h，24h時，eNOSmRNA灰度值分別為(3.88±0.77)，（2.97±0.24），（1.87±0.56），（1.54±0.51），HO-1mRNA灰度值分別為(2.48±0.44)，（2.20±0.46），（1.71±0.41），（1.61±0.40），SelS灰度值分別為（2.86±0.73），（2.11±0.47），（1.63±0.39），(1.33±0.45)。
　　 2.

16、Westernblotting結果顯示:濃度為10mg/L，20mg/L的SAA作用于細胞24h后可抑制eNOS，HO-1，SelS蛋白的表達且呈現(xiàn)出濃度依賴性，在SAA濃度10mg/L時灰度值分別為（0.26±0.06），（0.34±0.09），（0.27±0.08），在SAA濃度20mg/L時分別為（0.21±0.05），（0.20±0.06），（0.06±0.01）;SAA在20mg/L條件下作用0h，6h，12h，24h后，可抑

17、制eNOS，HO-1，SelS蛋白的表達，且呈現(xiàn)出時間依賴性，eNOS蛋白表達灰度值分別為（0.49±0.12），（0.39±0.10），（0.21±0.05），（0.20±0.06），HO-1蛋白表達灰度值分別為（0.44±0.12），（0.42±0.11），（0.36±0.09），（0.20±0.06），SelS蛋白表達分別為（0.36±0.10），(0.28±0.08)，（0.09±0.03），（0.06±0.01）。
　　

18、 3.MTT結果顯示10mg/L、20mg/LSAA作用12h、24h，可顯著抑制內皮細胞活性，10mg/L時分別為0.53、0.47，20mg/L時分別為0.50、0.42。
　　 4.10mg/L、20mg/L的SAA作用24h均能明顯減少內皮細胞中NO的含量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P＜0.05)，且SAA對NO含量的影響隨著濃度的增大而增強(圖20)。在10mg/L時NO含量為59.25±15.49μmol/

19、L，20mg/L時NO含量為44.36±12.46μmol/L，與0mg/L組比較分別減少了21.7％和41.4％。
　　 5.10mg/L、20mg/L的SAA作用24h后，能夠明顯增加ROS水平，在10mg/L時為22.34±4.42，在20mg/L為28.54±4.97。
　　 6.10mg/L、20mg/L的SAA作用24h后，能夠明顯降低T-AOC，在10mg/L時為0.72±0.20，在20mg/L為0.58

20、±0.18。
　　 結論：
　　 1.高濃度的SAA能夠明顯抑制eNOS、HO-1、SelS基因的轉錄和蛋白的表達且成濃度依賴性和時間依賴性，揭示了SAA濃度升高對細胞具有損傷作用，高濃度SAA作用時間越長對細胞的損傷越明顯;
　　 2.高濃度的SAA能降低內皮細胞的活性和細胞的總抗氧化能力，減少NO的產(chǎn)量，增強氧化應激反應，使ROS的水平升高，從而導致內皮細胞功能受損，促使動脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　 第

21、三部分：阿托伐他汀、硒對SAA誘導下eNOS、HO-1、SelS的調節(jié)作用
　　 目的：
　　 探討阿托伐他汀、硒對SAA誘導下的HUVECs中eNOS、HO-1、SelS分子表達和對NO、T-AOC、ROS的影響及作用機制。
　　 方法：
　　 把培養(yǎng)的HUVECs分為SAA組（加入SAA20mg/L），PDTC組(預先給予終濃度100μmol/L的NF-κB阻斷劑PDTC處理1h后加入SAA20mg/

22、L)，硒組(給予硒100nmol/L加SAA20mg/L)，阿托伐他汀組(阿托伐他汀10μmol/L加SAA20mg/L)、阿托伐他汀+硒組(阿托伐他汀10μmol/L加硒100nmol/L加SAA20mg/L)，24h后通過實時熒光定量(RT-PCR)測定各組eNOSmRNA、HO-1mRNA和SelSmRNA轉錄水平，免疫印跡法(Westernblotting)檢測eNOS、HO-1、SelS蛋白的表達;同時對細胞增殖及細胞培養(yǎng)液中

23、NO、T-AOC和ROS的含量進行測定和統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 1.阿托伐他汀組和硒組顯示出相似的結果，可以使eNOSmRNA、HO-1mRNA、SelSmRNA和蛋白表達明顯高于SAA組，結果具有統(tǒng)計學意義，阿托伐他汀組eNOSmRNA、HO-1mRNA、SelSmRNA分別為（2.57±0.05），（2.19±0.57）,（2.22±0.58）;eNOS、HO-1、SelS的蛋白表達分別為（0.28±0.1

24、3），（0.29±0.07）,（0.25±0.05）;硒組eNOSmRNA、HO-1mRNA、SelSmRNA分別為（2.13±0.40），（1.85±0.64），（2.01±0.55）;eNOS、HO-1、SelS的蛋白表達分別為（0.26±0.06），（0.33±0.08），（0.25±0.05）。
　　 2.阿托伐他汀加硒組eNOS、HO-1、SelS分子水平高于SAA組、阿托伐他汀組和硒組三組，與SAA組比較，結果具有統(tǒng)

25、計學意義，eNOSmRNA、HO-1mRNA、SelSmRNA分別為（4.13±0.25），(2.87±0.50)，（2.63±0.37）;eNOS、HO-1、SelS的蛋白表達分別為（0.39±0.09），（0.36±0.06），（0.33±0.06）。
　　 3.預先給予PDTC能夠阻斷SAA對eNOSmRNA、HO-1mRNA、SelSmRNA和蛋白表達的抑制作用，與SAA組比較，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　 4.給

26、予四種干預措施后結果顯示可以使細胞的活性增強，NO含量和T-AOC升高，ROS水平降低。NO含量在SAA組、Se組、Atv組、Se+Atv組、PDTC組分別（44.61±7.05）μmol/L，（52.58±7.16）μmol/L，（55.95±9.67）μmol/L，(70.94±10.92)μmol/L，（74.97±10.74）μmol/L，與SAA組比較分別增加了17.8％，25.4％，59.0％，68.1％;T-AOC分別為（

27、0.58±0.18）mmol/ml，（1.74±0.49）mmol/ml，(1.87±0.42)mmol/ml，（1.96±0.51)mmol/ml，（2.37±0.65)mmol/ml;ROS水平分別為（22.82±4.68），（18.97±4.69），（16.75±4.86），（10.64±2.36），（9.67±2.47）。
　　 結論：
　　 1.阿托伐他汀、硒均可改善高濃度SAA對eNOSmRNA、HO-1mR

28、NA、SelSmRNA和蛋白表達的抑制，能夠提高細胞活性，使NO產(chǎn)量升高，增強細胞總抗氧化能力，降低ROS的含量，兩者合用具有協(xié)同效應，提示阿托伐他汀、硒均能夠減輕氧化應激，具有細胞保護作用，兩者聯(lián)合使用效果增強;
　　 2.NF-κB的阻斷劑(PDTC)能夠阻斷高濃度SAA對eNOS、HO-1、SelS分子的抑制作用，增強細胞的活性，升高NO產(chǎn)量，使細胞T-AOC增強，ROS降低，提示SAA通過NF-κB途徑實現(xiàn)對內皮細胞的調