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文檔簡介
1、本文主要講述了以下幾個方面:
第一部分:APE1乙?;{節(jié)電離輻射誘導的Hela細胞自噬
研究背景:放射治療是晚期腫瘤主要的治療手段,但放療抵抗的現(xiàn)象普遍存在。APE1/Ref-1,DNA損傷修復和氧化還原(redox)雙功能基因,作為提高放射治療敏感性的靶點已經(jīng)被廣泛證實,但具體機制還在探索中。APE1是一個多功能蛋白,具有氧化還原一些轉錄因子(如P53、AP-1、PTEN、NF-kb等)和DNA堿基損傷修復的功能
2、。乙酰化、磷酸化、泛素化都是APE1翻譯后修飾的方式,但APE1乙?;揎椨葹橹匾?。APE1的N末端有多個位點能被乙酰化轉移酶修飾,尤其K6/K7位點的乙?;揎椗cAPE1多種活性密切相關,如與nCaRE序列、YB-1介導的MDR1基因激活和BER功能密切相關。自噬是細胞的一種適應性反應,應激刺激時細胞自我吞噬和降解細胞內的長壽蛋白和細胞器,從而維持細胞存活。細胞自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療存在密切的關系。為了探索APE1乙?;c電離輻
3、射(Ionizing Radiation IR)誘導的細胞自噬之間的關系,我們利用IR處理,觀察Hela細胞APE1乙?;?、細胞自噬水平的變化及可能的機制,為APE1作為放射治療的的靶點提供進一步的理論依據(jù)。
研究目的:探討脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子(apurinic/aprimidinicendonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)乙酰化對電離輻射誘導Hela細胞自噬的調節(jié)作
4、用。
研究方法:給予Elekta precise直線加速器處理Hela細胞0、2、4Gy照射24小時,或2Gy照射0、6、24、48小時后,應用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)的方法檢測APE1乙?;揎椉癇eclin1/Bcl2的結合,流式細胞儀檢測細胞自噬的水平,免疫熒光激光共聚焦檢測LC3的聚集,Western blot檢測APE1、LC3和p62的表達。
研究結果:Hel
5、a細胞APE1乙酰化水平隨著照射劑量的增加和照射后時間的延長而逐漸升高(P<0.05)。Hela細胞LC3Ⅱ的表達與照射劑量正相關,而與P62呈負相關(P.<0.05):電離輻射促進細胞的自噬水平和LC3的聚集。電離輻射后,LC3Ⅱ上調;與對照組APE1WT相比,APE1K6R/K7R細胞Beclin1/Bcl2結合增強,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,P62表達上調(P<0.05)。
研究結論:APE1乙?;ㄟ^Beclin1/
6、Bcl2途徑調節(jié)電離輻射誘導的Hela細胞自噬。
第二部分:genistein調節(jié)Beclin1依賴的細胞自噬促進放療敏感性
研究背景:放射治療最近把提高輻射精度,降低腫瘤發(fā)病率,減少對腫瘤組織劑量不足和對正常組織劑量過大機率考慮在內。為了更好達到腫瘤治療的目的,放射治療的輔助用藥應運而生。Genistein是黃豆天然產(chǎn)物大豆異黃酮的主要成分,一些體內體外研究證實,在前列腺癌,乳腺癌,結腸癌,胃癌,肺癌,胰腺癌,淋巴
7、瘤中具有明顯的抗腫瘤效應。Genistein明顯的提高腫瘤放射治療的療效,也能減輕放射治療對正常組織引起的炎性損傷。Genistein能夠提高化學治療誘導的細胞凋亡和自噬水平,其具體機制還不清楚。
Bcl-xl是bcl2家族的成員,與bcl-2蛋白均是抗凋亡蛋白的成員之一,bcl-xl在肺癌細胞中表達高于bcl-2。Bcl-xl的在前列腺癌細胞中的高表達和下調直接影響pc-3細胞對治療的敏感性。Bcl-xl與線粒體穩(wěn)定的結合,
8、抑制凋亡蛋白與線粒體的結合而抑制凋亡的發(fā)生;bcl-2家族抗凋亡蛋白定位于細胞核,主要是通過下調堿基切除修復酶APEI并與DNA修復酶APE1、XRCC1、c-Myc等相互結合抑制酶的活性抑制堿基切除修復。大量研究證實,Genistein抑制腫瘤細胞G2/M期促進細胞凋亡的發(fā)生,也促進肺部腫瘤放射治療和化學治療誘導的細胞自噬水平。Bcl-xl蛋白主要定位在線粒體膜,維持線粒體的穩(wěn)定、阻止細胞色素C的釋放和caspase蛋白的激活,發(fā)揮抗
9、凋亡的功能。現(xiàn)在證據(jù)表明bcl-xl蛋白也定位在內質網(wǎng),細胞核,并發(fā)揮一定的功能。Bcl-xl和Beclin1之間通過BH3區(qū)域相互結合組成的復合物是自噬調控的一個開關。
自噬是一個細胞自我分解的過程,細胞把要降解和循環(huán)利用長壽蛋白和細胞器吞入溶酶體進行降解,降解的細胞器有線粒體,過氧化物酶體,內質網(wǎng)。在機體處于饑餓和應激的正常情況下,自噬是有利于細胞存活的;但是越來越多的證據(jù)表明自噬過度刺激或始終激活,自噬也是促進細胞死亡的
10、程序。細胞自噬水平的過高或過低都不利細胞存活,許多抗腫瘤治療大多是誘導自噬發(fā)生。細胞凋亡調節(jié)的紊亂可在治療抵抗的腫瘤中普遍存在,幾乎所有的腫瘤都能維持凋亡的核心調控機制。
Genistein促進腫瘤治療誘導的凋亡水平,單用和聯(lián)用genistein明顯的抑制細胞漿內的bcl-xl的蛋白量。對于bcl2抗凋亡家族蛋白高表達的肺部腫瘤,genistein通過多種機制促進凋亡的發(fā)生。抗凋亡蛋白bcl-2家族與Beclin1結合發(fā)揮抗自
11、噬活性,也是維持細胞存活的途徑。改變抗細胞調往的bcl-2家族蛋白的入核情況和與Beclin1之間結合是誘導細胞自噬性凋亡的機制之一。
研究目的:探索Genistein引起NSCLC細胞中Bcl-xl亞細胞定位的改變與IR誘導的細胞凋亡、自噬之間的關系,為提高放射治療敏感性、減輕放射治療損傷反應提供可靠的輔助手段。
研究方法:利用細胞漿細胞核蛋白提取試劑盒分別提取核漿蛋白;通過westernBlot的方法檢測各種凋亡
12、自噬標志蛋白表達;用免疫熒光的方法檢測A549細胞Bcl-xl亞細胞定位的改變;流式細胞儀是在細胞水平檢測凋亡和自噬水平。
研究結果:肺癌細胞系胞漿Bcl-xl蛋白含量的差異影響IR誘導的細胞DNA損傷修復和細胞抗凋亡能力;Genistein改變A549細胞Bcl-xl蛋白的亞細胞定位,抑制IR誘導DNA損傷修復,促進Bcl-xl/Beclin1復合物的解離提高細胞的白噬水平,促進Bcl-2家族相關的多重凋亡途徑,而且NSCL
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