TFEB通過(guò)調(diào)節(jié)自噬降低腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性.pdf

1、目的：觀察化療藥物阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）蛋白表達(dá)的影響；探討TFEB是否通過(guò)自噬影響腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。
　　方法：細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性 TFEB及外源性GFP-TFEB細(xì)胞內(nèi)分布的影響；細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)分離細(xì)胞核，Western blot檢測(cè)阿霉素對(duì)細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中 TFEB蛋白表達(dá)的影響；采用質(zhì)粒 GFP-TFEB過(guò)表達(dá)和小干擾 RNA干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)TFEB蛋白水平后，CCK8法檢測(cè)

2、過(guò)表達(dá)和干擾 TFEB對(duì)阿霉素抑制腫瘤細(xì)胞作用的影響；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾 TFEB對(duì)阿霉素抑制腫瘤細(xì)胞增值能力的影響；Hoechst染色檢測(cè)干擾 TFEB聯(lián)合阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響；Western blot檢測(cè)干擾 TFEB聯(lián)合阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3蛋白表達(dá)的影響；Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾 TFEB聯(lián)合阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白 LC3表達(dá)的影響；使用自噬抑制劑3-MA及干擾自噬基

3、因ATG5抑制自噬后，CCK8法檢測(cè)自噬抑制后過(guò)表達(dá) TFEB對(duì)阿霉素抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示，阿霉素作用后，Lovo細(xì)胞內(nèi)源性 TFEB及外源性GFP-TFEB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核；核質(zhì)分離后Western blot結(jié)果顯示，阿霉素作用后，Lovo細(xì)胞內(nèi)TFEB在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)降低，在細(xì)胞核中表達(dá)增高；CCK8法結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TFEB后，阿霉素對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞和宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用

4、降低，而干擾TFEB后，阿霉素對(duì)Lovo細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用上升；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾TFEB后，阿霉素對(duì)Lovo細(xì)胞長(zhǎng)期存活的抑制能力增強(qiáng)；Hoechst染色結(jié)果顯示，干擾 TFEB增加阿霉素誘導(dǎo)的 Lovo細(xì)胞凋亡；Western blot結(jié)果顯示，干擾 TFEB增加阿霉素誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3表達(dá)上調(diào)；Western blot結(jié)果顯示，阿霉素作用后，Lovo細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)

5、TFEB增加阿霉素誘導(dǎo)的LC3表達(dá)上調(diào)，而抑制TFEB降低阿霉素誘導(dǎo)的LC3表達(dá)上調(diào)，且單獨(dú)干擾TFEB后LC3表達(dá)下調(diào)；使用自噬抑制劑3-MA和干擾ATG5來(lái)抑制自噬后，CCK8結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TFEB對(duì)Lovo細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用消失。
　　結(jié)論：阿霉素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞TFEB入核；TFEB降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素的化療敏感性，減少阿霉素引起的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存；TFEB調(diào)節(jié)阿霉素誘導(dǎo)的自噬激活；抑制自噬拮抗TFEB誘導(dǎo)