Hec1調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞對泰素敏感性的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：耐藥目前已經(jīng)成為了惡性腫瘤治療失敗的重要原因。最近研究發(fā)現(xiàn)，Hec1作為調(diào)節(jié)有絲分裂檢測點(diǎn)和著絲粒功能的基因，其在諸多腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)并與部分腫瘤的不良預(yù)后有著明顯的相關(guān)性。因此，我們通過RNAi干擾技術(shù)研究在卵巢癌細(xì)胞中Hec1對泰素化療敏感性的影響。
　　 方法：1）免疫組化檢測Hec1在正常卵巢及卵巢癌中的表達(dá)情況。2)脂質(zhì)體包裹Hec1 siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3，其中

2、轉(zhuǎn)染對照siRNA及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。3)Real-time PCR，western blot及細(xì)胞免疫熒光檢測Hec1 siRNA 對Hec1基因表達(dá)的干擾效應(yīng)。4）MTT、流式細(xì)胞儀、western blot、細(xì)胞免疫熒光檢測干擾Hec1后，卵巢癌細(xì)胞在泰素作用下的增殖、凋亡和周期改變情況。
　　 結(jié)果：1)免疫組化結(jié)果顯示，卵巢癌中Hec1的表達(dá)較正常卵巢明顯增高。2）與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染Hec1s

3、iRNA48小時后，Hec1mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。細(xì)胞免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染Hec1siRNA 48小時后著絲粒上附著的Hec1亦出現(xiàn)明顯的減少。3）MTT檢測結(jié)果顯示，Hec1siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組相比，在相同泰素濃度下，細(xì)胞的活性明顯降低,4）流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用50nM泰素處理24小時后，Hec1siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率較對照組增加25％左右。5）細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，Hec1siRNA轉(zhuǎn)染48小時細(xì)胞出現(xiàn)了較明

4、顯的周期阻滯，G2/M期細(xì)胞較對照組顯著增加，但是subG1期細(xì)胞并無明顯增加。同時western blot及免疫熒光檢測有絲分裂期特異性蛋白H3P的表達(dá)發(fā)現(xiàn)H3P的表達(dá)明顯增多。
　　 結(jié)論：抑制Hec1表達(dá)后，激活了有絲分裂檢測點(diǎn)，引起G2/M期阻滯細(xì)胞的增加，從而增加了細(xì)胞對泰素的敏感性。
　　 第二部分
　　 目的：探討MicroRNA-133(miR-133)通過調(diào)節(jié)RHOA蛋白的表達(dá)對乳腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞

5、系MCF-7侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 方法(1）將has-miR-133a inhibitor經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞，以Negative control作為陰性對照，將未做任何處理的細(xì)胞作為空白對照。（2)通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染has-miR-133a inhibitor后MCF-7細(xì)胞中miR-133的表達(dá)情況。（3）Transwell試驗和MTT檢測miR-133對于MCF-7細(xì)胞遷移能力和增殖能力的影響。（4

6、）細(xì)胞免疫熒光觀察miR-133對于細(xì)胞骨架形態(tài)的影響。（5）Western blot檢測miR-133對于RHOA蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：(1)轉(zhuǎn)染has-miR-133a inhibitor后MCF-7細(xì)胞中miR-133的表達(dá)較對照組明顯減低。（2）Transwell試驗和MTT結(jié)果表明抑制 miR-133后可以增加細(xì)胞的遷移能力而對細(xì)胞的增殖能力沒有影響。（3）細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提示抑制 miR-133后細(xì)胞骨架形態(tài)