miR-1307對(duì)卵巢癌細(xì)胞藥物敏感性的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)擴(kuò)大臨床樣本明確miR-1307及CIC mRNA與蛋白在化療耐藥與敏感卵巢癌組織中的表達(dá)情況及與耐藥的關(guān)系，研究二者的相關(guān)性及與化療耐藥與敏感卵巢癌臨床病理生物學(xué)特征之間的關(guān)系，探討miR-1307作為卵巢癌耐藥預(yù)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志的可能性。
　　同時(shí)，構(gòu)建miR-1307過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入紫杉醇敏感及耐藥的卵巢癌細(xì)胞系，隨后加入不同濃度紫杉醇處理，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、凋亡及周

2、期檢測(cè)等方法研究miR-1307改變后耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的變化情況，以探索體外條件下改變miR-1307水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇藥物敏感性的影響，明確miR-1307在卵巢癌紫杉醇耐藥中的作用。
　　最后，通過(guò)研究卵巢癌細(xì)胞中miR-1307靶向調(diào)控CIC蛋白表達(dá)的作用，并通過(guò)改變miR-1307的表達(dá)研究RAS、ERK與ETV4、ETV5的表達(dá)變化，干擾CIC蛋白表達(dá)研究CIC蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇藥物敏感性的影響，

3、以研究miR-1307通過(guò)調(diào)控CIC蛋白的表達(dá)影響RAS、ERK與ETV4、ETV5介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性的作用。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　選取2009年1月至2012年1月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為卵巢癌的患者，經(jīng)手術(shù)切除卵巢病灶且經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為卵巢漿液性囊腺癌的新鮮組織標(biāo)本。所有患者術(shù)后均行TP方案（紫杉醇+鉑類(lèi)）化療，完成TP方案化療療程后均進(jìn)行隨訪。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法

4、
　?。ㄒ唬┗熌退幣c敏感卵巢癌組織miR-1307、CIC mRNA與蛋白表達(dá)及其相關(guān)性研究
　　1、采用RNA提取、蛋白提取、反轉(zhuǎn)錄、real time PCR、western blot等方法檢測(cè)化療耐藥與敏感卵巢癌組織miR-1307、CIC mRNA與蛋白的表達(dá)并進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析;
　　2、應(yīng)用方差齊性檢驗(yàn)、Bonferroni檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析miR-1307及CIC蛋白表達(dá)水平與卵巢癌臨床

5、病理生物學(xué)特征之間的關(guān)系;
　?。ǘ﹎iR-1307對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇藥物敏感性的影響
　　1、采用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、雙酶切、PCR擴(kuò)增、DNA連接、重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及單克隆篩選、DNA測(cè)序等方法構(gòu)建miR-1307過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體，培養(yǎng)miR-1307穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)的SKOV3、SKOV3-TR30細(xì)胞系。
　　2、采用MTT、凋亡檢測(cè)及細(xì)胞周期檢測(cè)等方法，配合細(xì)胞培養(yǎng)等方法研究miR-1307穩(wěn)定

6、過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)的SKOV3及SKOV3-TR30細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特征的變化及對(duì)紫杉醇的藥物敏感性。
　?。ㄈ﹎iR-1307調(diào)控CIC介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞藥物敏感性的分子機(jī)制研究
　　1、采用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、雙酶切、PCR擴(kuò)增、DNA連接、重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及單克隆篩選、DNA定點(diǎn)突變、DNA測(cè)序、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等方法研究miR-1307與CIC3'-UTR區(qū)的直接結(jié)合作用。
　　2、采用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞瞬

7、時(shí)轉(zhuǎn)染、western blot的方法培養(yǎng)CIC抑制表達(dá)的SKOV3細(xì)胞并進(jìn)行CIC蛋白含量檢測(cè)以確定CIC siRNA的抑制作用。
　　3、采用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建miR-1307及CIC蛋白表達(dá)均抑制的SKOV3-TR30細(xì)胞，并通過(guò)western blot方法檢測(cè)CIC含量的變化。
　　結(jié)果：
　　一、化療耐藥與敏感卵巢癌組織miR-1307、CIC mRNA與蛋白表達(dá)及其相關(guān)性研究
　　1、m

8、iR-1307在化療耐藥卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于化療敏感卵巢癌組織，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、CIC mRNA在化療耐藥卵巢癌組織中相對(duì)表達(dá)量高于化療敏感卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、與化療敏感組相比，化療耐藥組中CIC蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、CIC蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞胞漿，亦有細(xì)胞核表達(dá)。40例卵巢癌組織CIC蛋白細(xì)胞漿高表達(dá)陽(yáng)性率為67.5％(27/40)，中度表達(dá)陽(yáng)性率為

9、27.5％(11/40)，低表達(dá)陽(yáng)性率5％(2/40)，細(xì)胞核表達(dá)率為22.5％(9/40)。
　　二、miR-1307對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇藥物敏感性的影響
　　1、成功構(gòu)建miR-1307過(guò)表達(dá)載體及抑制表達(dá)載體。
　　2、CIC蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-1307過(guò)表達(dá)載體的SKOV3細(xì)胞miR-1307相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-1307抑

10、制載體的SKOV3-TR30細(xì)胞miR-1307相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、miR-1307調(diào)控CIC介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞藥物敏感性的分子機(jī)制研究
　　1、miR-1307與CIC3'-UTR區(qū)具有直接結(jié)合作用。
　　2、轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-1307后，CIC mRNA相對(duì)表達(dá)量與CIC蛋白表達(dá)均明顯降低，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染抑制表達(dá)miR-1307后CIC mRNA相對(duì)表達(dá)量、CIC

11、蛋白表達(dá)均明顯升高，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-1307的SKOV3細(xì)胞中ETV4、ETV5蛋白表達(dá)增加，RAS蛋白及p-ERK蛋白表達(dá)增加，與對(duì)照細(xì)胞相比，增加的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定抑制表達(dá)miR-1307的SKOV3-TR30細(xì)胞中ETV4、ETV5蛋白表達(dá)減少，RAS蛋白及p-ERK蛋白表達(dá)減少，與對(duì)照細(xì)胞相比，減少的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、化療

12、耐藥卵巢漿液性癌組織miR-1307的表達(dá)量高于敏感組織，而且miR-1307表達(dá)水平的ROC曲線分析結(jié)果顯示其可以作為預(yù)測(cè)卵巢癌患者化療耐藥的指標(biāo)之一，說(shuō)明miR-1307可能與卵巢癌化療耐藥有關(guān)。
　　2、在卵巢漿液性癌組織中，CIC蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞胞漿，亦有細(xì)胞核表達(dá)?；熌退幝殉矟{液性癌組織CIC蛋白細(xì)胞漿高表達(dá)陽(yáng)性率、細(xì)胞核表達(dá)陽(yáng)性率與CIC蛋白表達(dá)量均低于敏感組織，而且miR-1307與CIC蛋白的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)關(guān)

13、系，推測(cè)miR-1307及CIC在卵巢癌耐藥中可能起一定作用。
　　3、miR-1307及CIC蛋白的表達(dá)均與卵巢癌患者的臨床病理生物學(xué)特征無(wú)明顯相關(guān)性，但二者都與卵巢癌的耐藥相關(guān)。
　　4、miRNA-1307在紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞系SKOV3-TR30中表達(dá)高于敏感細(xì)胞系SKOV3; CIC mRNA表達(dá)在紫杉醇耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CIC蛋白在紫杉醇敏感卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中表達(dá)高于耐藥卵巢癌

14、細(xì)胞系SKOV3-TR30;即在紫杉醇耐藥與敏感卵巢癌細(xì)胞中miR-1307與CIC蛋白的表達(dá)均呈相反趨勢(shì)。
　　5、miR-1307表達(dá)升高使卵巢癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，凋亡減少，S期細(xì)胞百分比增加，IC50增高，經(jīng)紫杉醇處理后，相同濃度紫杉醇對(duì)細(xì)胞抑制率降低，凋亡及阻滯在G2期細(xì)胞百分比減少，提示miR-1307表達(dá)增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，抑制了卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，促進(jìn)耐藥的產(chǎn)生;miR-1307表達(dá)降低使卵巢癌細(xì)

15、胞增殖能力減弱，凋亡增加，S期細(xì)胞百分比降低，IC50降低，經(jīng)紫杉醇處理后，相同濃度紫杉醇對(duì)細(xì)胞抑制率升高，凋亡及阻滯在G2期細(xì)胞百分比增加，提示miR-1307表達(dá)降低抑制了卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，抑制耐藥的產(chǎn)生。因此認(rèn)為，miR-1307表達(dá)水平的改變既即影響了卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為，又影響了卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物的敏感性。
　　6、miR-1307可能通過(guò)CIC影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物的敏

16、感性。
　　7、卵巢癌細(xì)胞中miR-1307通過(guò)與CIC3'-UTR區(qū)靶向結(jié)合調(diào)控CIC表達(dá)。
　　8、卵巢癌細(xì)胞中，隨著miR-1307表達(dá)升高或降低，RAS、活性p-ERK與ETV4、ETV5蛋白表達(dá)增加或減少，表明miR-1307靶向沉默CIC可影響RAS、ERK與ETV4、ETV5蛋白的表達(dá)。
　　9、CIC表達(dá)降低促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，IC50增高，相同濃度紫杉醇對(duì)細(xì)胞抑制率降低，凋亡及阻滯在G2期細(xì)胞百分比

17、減少，提示CIC表達(dá)降低抑制卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，促進(jìn)耐藥的產(chǎn)生。因此，CIC可調(diào)控卵巢癌細(xì)胞藥物敏感性，初步闡明miR-1307通過(guò)CIC影響卵巢癌細(xì)胞紫杉醇藥物敏感性。
　　10、卵巢癌細(xì)胞中，隨著miR-1307與CIC表達(dá)同時(shí)降低，與僅有miR-1307表達(dá)下降的細(xì)胞相比，細(xì)胞的增殖能力重又增強(qiáng)，IC50增加，相同濃度紫杉醇對(duì)細(xì)胞抑制率降低，凋亡減少，阻滯在G2期細(xì)胞百分比減少，RAS蛋白、p-ERK蛋白及CIC的下