缺營養(yǎng)誘發(fā)膽管癌細胞自噬對化療藥物敏感性影響及機制研究.pdf

1、膽管癌(Cholangiocarcinoma)是全球常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。膽管癌的治療目前仍是以手術為主的綜合治療，手術為其首選治療方法，但由于腫瘤分化程度低，惡性度高，使得手術后復發(fā)率高，預后差。而晚期腫瘤患者，已喪失手術機會，治療以放化療為主，但膽管癌對放化療不敏感，治療效果差，預后不佳。因此，研究膽管癌對化療的不敏感性對提高膽管癌的療效以及提高病人生存率有很重要的意義。
　　 雖然目前對膽管癌的耐藥機

2、制研究較多，但確切的機制仍不清楚。新近研究表明，細胞自噬可能與腫瘤的耐藥有關。細胞對自噬的形成有著精細的調節(jié)，這過程有多種基因的參與，這些基因稱為自噬相關基因atg(autophagy related gene)，它們編碼的蛋白參與自噬的誘導、產生、成熟和再循環(huán)，同時自噬還受到一些信號途徑如PI-3K/AKT/mTOR及p38-MAPK等的調控。自噬的過程受一系列復雜的信號調控，自噬異常與腫瘤發(fā)生、神經退行性疾病、衰老等有重要的聯(lián)系。p

3、53是一種著名的腫瘤抑制基因以及功能蛋白，對抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著非常重要的作用。但在所有惡性腫瘤中，僅有50％左右會出現(xiàn)該基因的突變，其他的發(fā)病機制尚不明確。有研究表明，在p53表達而引起細胞凋亡的情況下，只有在未發(fā)生細胞凋亡的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)細胞自噬。所以，在缺血缺營養(yǎng)環(huán)境中，膽管癌細胞的凋亡逃逸乃至對化療藥物的抵抗，極有可能由自噬介導并有p53基因的參與。為證實這一猜想，本課題從以下兩方面進行研究：第一部分研究缺血缺營養(yǎng)對膽管癌細胞

4、化療敏感性的影響；第二部分研究在缺血缺營養(yǎng)環(huán)境中p53參與的自噬在膽管癌細胞對化療藥物不敏感中的作用機制。
　　 本研究首先將膽管癌細胞系(QBC)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，分別用化療藥物(5FU、順鉑)處理12h，利用cck8法檢測細胞活性，用DAPI染色來檢測細胞死亡，以全營養(yǎng)和缺營養(yǎng)情況下未用藥的對照組為基準，比較不同營養(yǎng)情況下膽管癌細胞在化療藥作用下的死亡率。結果發(fā)現(xiàn)缺營養(yǎng)情況下膽管癌細胞

5、對化療藥物的敏感性降低。由于缺血缺營養(yǎng)是細胞發(fā)生自噬的天然誘導劑，新近的研究表明自噬與腫瘤對化療不敏感有關，這些研究提示我們，自噬可能參與了膽管癌細胞對化療的抗性，因此我們進一步研究膽管細胞癌缺營養(yǎng)是否誘導了自噬的發(fā)生。
　　 隨后，將膽管癌細胞系(QBC)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，應用電子透射顯微鏡檢測自噬小體，比較不同營養(yǎng)情況下自噬的表達情況。同時我們也利用轉染LC3-GFP質粒檢測和比較不同

6、營養(yǎng)情況下膽管癌細胞成點狀綠色熒光的數(shù)量；結果表明，膽管癌細胞在缺營養(yǎng)情況下自噬小體的形成數(shù)量要高于全營養(yǎng)情況，同時成點狀綠色熒光的數(shù)量也明顯增多。這些結果表明膽管細胞癌在缺營養(yǎng)情況下誘導了自噬的發(fā)生。
　　 對膽管癌自噬的進一步的研究還證實抑制自噬增加腫瘤細胞在缺營養(yǎng)情況下的死亡率和對化療的敏感性。將膽管癌細胞系(QBC)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，預先應用自噬抑制劑(3MA)作用2h，分別用化療

7、藥物(5FU、順鉑)處理12h，利用cck8法檢測細胞活性，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，用DAPI染色來檢測細胞凋亡，比較和觀察在全營養(yǎng)、缺營養(yǎng)及缺營養(yǎng)加自噬抑制劑情況下，腫瘤細胞的死亡情況以及在化療藥物作用下的死亡情況。結果發(fā)現(xiàn)在抑制自噬和缺營養(yǎng)的情況下，腫瘤細胞死亡增加，同時腫瘤細胞對化療藥物的敏感性也增加。
　　 綜合上面的實驗結果，我們的研究表明自噬不但是膽管癌細胞在缺營養(yǎng)情況下的生存機制之一，同時也有助于膽管

8、癌細胞抵抗的化療的作用。但是目前關于自噬抵抗化療的具體機制還不是很清楚。自噬是體內唯一的一個降解細胞器的途徑，同時已有研究也顯示p53在腫瘤細胞的自噬發(fā)生過程起到很重要的作用。因此在膽管癌細胞中我們關注p53在自噬誘導膽管癌細胞對化療藥物不敏感中的作用。
　　 在進一步的實驗中，我們將膽管癌細胞系(QBC)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，預先應用p53抑制劑PFT-a作用1h，然后繼續(xù)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬

9、誘導培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中12h。應用電子透射顯微鏡檢測自噬小體的形成。同時我們也利用轉染LC3-GFP質粒檢測和比較p53抑制和未抑制情況下膽管癌細胞成點狀綠色熒光的數(shù)量；結果表明，膽管癌細胞在缺營養(yǎng)聯(lián)合p53抑制情況下自噬小體的形成數(shù)量低于p53未抑制情況，同時成點狀綠色熒光的數(shù)量也明顯減少。進一步的研究還顯示在p53抑制聯(lián)合缺營養(yǎng)的情況下，分別用化療藥物(5FU、順鉑)處理24h，利用cck8法檢測細胞活性，在相差顯微

10、鏡倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，用DAPI染色來檢測細胞凋亡，比較和觀察在全營養(yǎng)、缺營養(yǎng)及缺營養(yǎng)加自噬抑制劑情況下，腫瘤細胞的死亡情況以及在化療藥物作用下的死亡情況。結果發(fā)現(xiàn)在缺營養(yǎng)的情況下抑制p53增加腫瘤細胞死亡，同時腫瘤細胞對化療藥物的敏感性也增加。這個結果表明p53的激活可能參與了膽管癌對化療的不敏感。
　　 綜上所述，本課題得出以下結論：
　　 1、營養(yǎng)缺乏能誘導膽管癌細胞激活自噬，自噬能誘導膽管癌細胞對