細(xì)胞自噬在肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性死亡中的作用及對藥物敏感性的影響.pdf

1、研究背景:原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)惡性程度高、預(yù)后差,是危害我國居民健康的重大疾病,而其多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象更是影響內(nèi)科藥物治療療效的重要因素。深入探討HCC惡性增殖和藥物抵抗的機制、尋找有效的干預(yù)靶點已經(jīng)成為肝癌研究的熱點。肝癌細(xì)胞始終處于病毒感染、營養(yǎng)缺乏、炎癥刺激等各種不良的微環(huán)境中,這些不良刺激加上腫瘤的惡性增殖會使得大量未折疊/錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的積聚,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)狀態(tài)。研究證實,ERS以及其引發(fā)的未折疊蛋

2、白反應(yīng)(UPR)與眾多的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān),因此探討ERS狀態(tài)下的肝癌細(xì)胞增殖、生存和死亡的機制具有重要的意義。自噬是細(xì)胞在缺氧、營養(yǎng)缺乏環(huán)境下通過自身降解來維持生存和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。近年研究表明,自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的治療均有密切關(guān)系,但自噬究竟是發(fā)揮促癌還是抑癌的作用目前尚無定論。研究ERS狀態(tài)下肝癌細(xì)胞的自噬活性的變化,以及自噬在肝癌細(xì)胞生存和死亡中的作用有助于進(jìn)一步闡明肝癌的惡性生物學(xué)的分子基礎(chǔ)和藥物抵抗機制。

3、r>　　研究目的:①觀察ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(TM)對肝癌細(xì)胞自噬活性的影響;②研究細(xì)胞自噬在ERS誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡中的作用;③探討化療藥物對肝癌細(xì)胞自噬的影響及調(diào)控自噬對肝癌細(xì)胞藥物敏感性的影響。
　　方法:肝癌細(xì)胞株HepG2、HepG2.2.15和Bel7402分別培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM、MEM和RPMI1640培養(yǎng)基中;正常肝細(xì)胞L02培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中。采用CCK?8法檢測細(xì)胞活力,并根據(jù)細(xì)胞活

4、力值在OriginPro8.5.1軟件中進(jìn)行劑量效應(yīng)曲線擬合,分別計算TM及奧沙利鉑(Oxa)對各細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50),據(jù)此設(shè)計自噬誘導(dǎo)試驗的濃度。免疫印跡法檢測ERS標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)及caspase?3蛋白的切割情況。自噬的檢測與評價包括以下4個方面:a)形態(tài)學(xué)定性:采用透射電子顯微鏡法(TEM)觀察自噬體的超微結(jié)構(gòu),以EBSS和雷帕霉素處理的細(xì)胞作為自噬誘導(dǎo)的陽性對照;b)細(xì)胞爬片經(jīng)免疫熒光染色,在激光共聚焦顯微

5、鏡下觀察LC3蛋白在胞漿內(nèi)的定位表達(dá)情況;c)免疫印跡法檢測自噬性LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白的轉(zhuǎn)變(conversion試驗)并進(jìn)行定量分析;d)自噬潮(autophagicflux)分析:以氯喹(CQ)作為溶酶體抑制劑,觀察CQ存在與不存在的情況下LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的變化(LC3turnover試驗),以全面評價自噬性降解功能。
　　結(jié)果:①肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞對ERS刺激的耐受性:在相同濃度TM刺激下,3種肝癌細(xì)胞株(HepG2、

6、HepG2.2.15和Bel7402)的細(xì)胞活力均高于正常肝細(xì)胞L02的活力。②ERS誘導(dǎo)劑對HepG2細(xì)胞活力的影響:HepG2細(xì)胞的活力隨TM作用時間的延長和劑量的增加而下降;經(jīng)計算后,TM對HepG2細(xì)胞的IC50值=6.4606μg/ml;且TM處理的HepG2細(xì)胞中見caspase3蛋白的切割現(xiàn)象。③HepG2細(xì)胞內(nèi)ERS標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)的變化:免疫印跡檢測證實,TM刺激可以引起HepG2細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)的上調(diào)。G

7、RP78蛋白表達(dá)水平與TM的濃度呈正相關(guān),且隨著TM作用時間的延長,GRP78表達(dá)水平逐漸增加。④ERS對肝癌HepG2細(xì)胞自噬的影響:a)TEM觀察發(fā)現(xiàn),2.5μg/mlTM作用24小時后的HepG2細(xì)胞中自噬體(即包裹著胞漿成分的囊泡樣結(jié)構(gòu))較對照組明顯增多。b)激光共聚焦顯微鏡下亦發(fā)現(xiàn)LC3蛋白在TM處理后的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加,呈點狀聚集現(xiàn)象。c)WesternBlot證實ERS后的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)了自噬性的LC3Ⅰ

8、向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)變。2.5μg/ml和5μg/ml的TM作用于HepG2后,與對照組相比,LC3Ⅰ蛋白表達(dá)下調(diào),同時LC3Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào);條帶定量分析的結(jié)果提示TM處理組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ光密度比值大于對照組,且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ光密度比值隨TM處理時間的增加而增加;而自噬抑制劑3?甲基腺嘌呤(3MA)可抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)變。d)自噬潮分析(LC3turnover試驗)的結(jié)果示:CQ抑制溶酶體后,LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平較不加CQ的相

9、同濃度的TM組明顯增多;定量分析結(jié)果提示TM+CQ組的LC3Ⅱ光密度值較不加CQ的相同濃度TM組增加;同時,TEM亦證實CQ存在時,TM處理的HepG2細(xì)胞中出現(xiàn)更多的自噬體的積聚。以上結(jié)果說明了ERS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬增加是自噬功能增強的結(jié)果,而非自噬性降解缺陷所致自噬體積聚。⑤抑制自噬對ERS狀態(tài)下HepG2細(xì)胞活力的影響:在加入TM前1小時加入3MA用來抑制自噬的發(fā)生,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制自噬可增加ERS狀態(tài)下的HepG2細(xì)胞死亡;

10、提高3?MA濃度,細(xì)胞活力下降更明顯。而提前加入CQ則對ERS狀態(tài)下的肝癌細(xì)胞活力影響不大。⑥奧沙利鉑(Oxa)對HepG2細(xì)胞自噬的影響:電鏡下,Oxa作用下的HepG2細(xì)胞自噬體增加;Western Blot證實Oxa誘導(dǎo)LC3 Ⅱ蛋白的表達(dá)增加,而且CQ抑制溶酶體后LC3?Ⅱ蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增加。以上結(jié)果說明Oxa可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的自噬增加。⑦自噬抑制對肝癌細(xì)胞藥物敏感性的影響:3MA可以下調(diào)LC3Ⅱ的表達(dá),抑制自噬的發(fā)生。

11、3MA+Oxa共處理可以引起肝癌HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞活力的顯著下降。CQ+Oxa聯(lián)合處理24小時對肝癌細(xì)胞活力影響不大,48小時后的活力則較Oxa單獨處理組明顯下降。
　　結(jié)論:與正常肝細(xì)胞相比,肝癌細(xì)胞對ERS刺激的耐受性更強;ERS可以誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬的形成增加和自噬潮的增強,且隨著ERS誘導(dǎo)劑TM作用時間和劑量的增加而增加;自噬活性增強是肝癌HepG2細(xì)胞耐受ERS刺激的重要機制,自噬抑制劑3MA可