蟲草素通過(guò)調(diào)節(jié)自噬抑制細(xì)胞泡沫化作用機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是由于動(dòng)脈壁脂質(zhì)代謝失衡和免疫功能紊亂進(jìn)而引發(fā)的慢性炎癥疾病，其中，巨噬細(xì)胞泡沫化導(dǎo)致脂質(zhì)在血管內(nèi)膜的積累是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞自噬能夠抵抗外界的刺激，將細(xì)胞內(nèi)損傷成分降解為小分子物質(zhì)供機(jī)體重新利用，維持能量代謝平衡。相關(guān)研究表明，適度的巨噬細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流出，延緩AS的發(fā)生發(fā)展。蟲草素是我國(guó)傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草中提取分離的特有生物活性成分，具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒等

2、多種藥理作用，目前關(guān)于蟲草素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用和機(jī)制鮮有報(bào)道。為了系統(tǒng)的研究蟲草素調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞形成的作用及分子機(jī)制，本論文對(duì)蟲草素在RAW264.7細(xì)胞中與自噬和細(xì)胞泡沫化的關(guān)系進(jìn)行探討。
　　本研究采用氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立泡沫細(xì)胞模型，考察蟲草素對(duì)細(xì)胞泡沫化的抑制作用及其分子機(jī)制。采用油紅O染色測(cè)值、TC含量測(cè)定評(píng)價(jià)蟲草素對(duì)脂質(zhì)堆積的影響;選擇熒光標(biāo)記法分析蟲草素對(duì)膽固醇流入、流出的影響;RT-PC

3、R測(cè)定相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。隨后，檢測(cè)蟲草素對(duì)細(xì)胞自噬的影響，選擇Western blot技術(shù)檢測(cè)p62、LC3的蛋白表達(dá)確定自噬水平，通過(guò)間接免疫熒光染色法特異性定位蛋白p62、LC3從而觀察RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的自噬現(xiàn)象;利用透射電鏡法直觀觀察RAW264.7細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量。最后，對(duì)自噬及自噬上游通路關(guān)鍵分子AMPK、mTOR進(jìn)行特異性干擾，通過(guò)Westem blot技術(shù)檢測(cè)p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTO

4、R、p62、LC3等相關(guān)蛋白的表達(dá)并進(jìn)行定量分析，同時(shí)檢測(cè)在此過(guò)程中蟲草素對(duì)細(xì)胞泡沫化作用的影響，深入探究蟲草素通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬改善泡沫化的作用及分子機(jī)制。進(jìn)而對(duì)蟲草素調(diào)控自噬的分子生物學(xué)機(jī)制以及發(fā)揮抑制細(xì)胞泡沫化的作用途徑進(jìn)行初步的探討。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10μmol/L蟲草素顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積，促進(jìn)高密度脂蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流出，同時(shí)抑制細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取，RT-PCR結(jié)果表明，蟲

5、草素顯著調(diào)節(jié)膽固醇流入、流出關(guān)鍵因子的mRNA水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蟲草素抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化。通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)蟲草素與自噬的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系，結(jié)果顯示，10μmol/L蟲草素處理RAW264.7細(xì)胞12h后明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞中的自噬，具體表現(xiàn)為促進(jìn)p62蛋白的降解和LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化。同時(shí)，間接免疫熒光法證明蟲草素顯著促進(jìn)了自噬的發(fā)生;透射電鏡下明顯觀察蟲草素處理后的細(xì)胞中自噬小體增多，自噬現(xiàn)象明顯

6、。以上現(xiàn)象表明，蟲草素顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中的自噬。采用相應(yīng)的化合物干擾細(xì)胞內(nèi)的自噬及mTOR和AMPK的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，利用氯喹特異性的抑制細(xì)胞晚期自噬，可以顯著降低蟲草素促進(jìn)自噬的作用;選擇亮氨酸促進(jìn)mTOR的表達(dá)，蟲草素不能促進(jìn)自噬同時(shí)mTOR的磷酸化水平升高;抑制AMPK的表達(dá)阻斷了蟲草素調(diào)節(jié)自噬的作用，具體表現(xiàn)為AMPK的磷酸化水平降低，mTOR的磷酸化水平升高，p62蛋白表達(dá)上調(diào)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例下降，表

7、明蟲草素通過(guò)AMPK/mTOR的信號(hào)途徑促進(jìn)自噬。干擾晚期自噬，AMPK、mTOR的表達(dá)水平抑制了蟲草素促進(jìn)細(xì)胞自噬的功能，同時(shí)下調(diào)抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的作用，抑制膽固醇流出及相關(guān)基因的表達(dá)。以上結(jié)果證明蟲草素通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)途徑促進(jìn)自噬進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。
　　綜上所述：本研究首次證實(shí)，蟲草素通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞自噬，進(jìn)而發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的作用，蟲草素可能在治療AS過(guò)程中具有重