Apelin-13誘導自噬促進泡沫細胞膽固醇流出的作用及機制.pdf

1、動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，As）性心腦血管疾病是一類嚴重危害人類健康和生命的重大疾病，其發(fā)生機制涉及炎癥、損傷應答和脂質代謝異常等眾多因素。其中單核細胞分化為巨噬細胞，吞噬脂蛋白源性的過量膽固醇，進而在血管壁上形成泡沫細胞，是動脈粥樣硬化發(fā)病過程中的一個關鍵事件。自噬(autophagy)是細胞利用溶酶體系統降解細胞聚集蛋白、受損細胞器和各種大分子物質的過程。近年研究表明自噬與As緊密相關，一種自噬特殊形式—脂噬(l

2、ipophagy)，能將巨噬細胞內膽固醇酯（cholesterol ester, CE）運輸至溶酶體，被溶酶體脂酶降解后通過細胞膜蛋白三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)運送至高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)，促進巨噬細胞內膽固醇流出。因此自噬是促進細胞膽固醇流出和防治動脈粥樣硬性心血管疾病的一個潛在靶標。
　　Ap

3、elin是脂肪細胞分泌的一種脂肪因子，具有生物活性的肽類激素，在體內組織分布廣泛，尤其在心血管組織高表達。它與其受體構成Apelin/APJ系統，主要參與血管氧化應激反應過程，對心血管系統有重要的調節(jié)作用。體內常見的有apelin-36、17、13、和12等幾種形式，其中生物活性最強是apelin-13。在心血管疾病患者血漿中apelin水平比正常人顯著下降，并與動脈粥樣斑塊的發(fā)展及穩(wěn)定密切相關。提示apelin具有抗動脈粥樣硬化作用，

4、但具體機制尚未明了。
　　自噬的過程及其機制復雜，受許多信號通路調控，其中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinases,PI3Ks）是自噬途徑中的關鍵調節(jié)分子。其中Class I PI3K和Class III PI3K信號途徑在不同時期調控自噬作用。新近研究發(fā)現apelin通過PI3Ks信號通路誘導自噬參與細胞的保護作用，提示apelin抗As作用與自噬密切相關。
　　本研究從自噬入手，并通過不同方

5、法干預PI3Ks信號途徑，觀察其對apelin-13作用的影響，以探討apelin-13與自噬之間的作用關系及信號傳導機制，從而為揭示apelin-13在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的可能作用和機制提供新的研究思路。
　　第一部分、Apelin-13通過誘導自噬對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響
　　目的：觀察apelin-13對 THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出和自噬的作用，同時觀察apelin-13調控自

6、噬變化對細胞膽固醇流出的影響。
　　方法：培養(yǎng)THP-1單核細胞，用佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)誘導THP-1細胞貼壁分化為巨噬細胞。THP-1源性巨噬細胞與ox-LDL共孵育分化、形成泡沫細胞，得到巨噬細胞源性泡沫細胞模型。用apelin-13處理泡沫細胞，觀察apelin-13對膽固醇流出、自噬相關蛋白表達影響的濃度效應和時間效應。分別用液體閃爍計數法、油紅O染色及高效液相色譜法

7、檢測細胞內膽固醇的流出、脂滴及膽固醇水平。構建熒光真核表達載體pcDNA3.1-GFP-LC3，轉染巨噬細胞，通過熒光顯微鏡觀察各組細胞中自噬體形成情況，采用Western blotting免疫印跡分別檢測細胞中LC3和p62蛋白質的表達。用apelin抑制劑百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)、自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin）、自噬抑制劑長春花堿(vinblastine)對apelin-13作用下的細胞共處理，

8、檢測細胞內自噬活性，并觀察細胞內脂質蓄積和膽固醇流出的影響。
　　結果：不同濃度的apelin-13（0，1，10，100nM apelin-13）處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞24h后，液體閃爍計數法檢測發(fā)現細胞內膽固醇流出增多。高效液相色譜法檢測顯示細胞內膽固醇含量明顯減少，同時油紅O也證實細胞內脂滴明顯減少，并且以上效應呈濃度依賴性。Western blotting檢測自噬蛋白的表達，結果顯示，apelin-13可呈濃度

9、依賴性上調細胞LC3蛋白的表達，而下調p62表達。以100nM apelin-13不同時間（0，6，12，24小時）分別處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞，結果發(fā)現，細胞內脂滴蓄積明顯降低，細胞內膽固醇含量顯著減少，細胞內流出的膽固醇明顯增加，且隨時間的延長，效應越明顯，提示apelin-13的作用呈時間依賴性。Western blotting免疫印跡檢測發(fā)現細胞中LC3蛋白表達呈時間依賴性的上調，p62表達呈時間依賴性下調。Apeli

10、n抑制劑 PTX預處理細胞后，apelin-13對上述的效應隨即取消。自噬激動劑rapamycin預處理細胞后，增強apelin-13對細胞的自噬，增加了自噬體數量，促進了細胞內膽固醇流出，減少細胞內脂質蓄積。而自噬抑制劑vinblastine預處理細胞后，減弱apelin-13對細胞自噬的影響，減少了自噬體數量，抑制了細胞內膽固醇流出，促進細胞內脂質蓄積。
　　結論：①apelin-13呈濃度依賴性和時間依賴性的方式促進THP-

11、1巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇的流出，減少細胞內膽固醇的蓄積；②apelin-13以時間依賴性和濃度依賴性的方式上調LC3、下調p62表達，促使自噬體形成。③apelin-13通過自噬，增加巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出，減少脂質蓄積，抑制泡沫細胞的形成。
　　第二部分、Apelin-13通過誘導自噬對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的分子機制
　　目的：探討apelin-13誘導THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞自噬和

12、促進細胞內膽固醇流出的分子機制。
　　方法：培養(yǎng)THP-1細胞株，以佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)和ox-LDL誘導分化并形成泡沫細胞，復制巨噬細胞源性泡沫細胞模型。采用apelin-13和（或）Class I PI3K及ClassIII PI3K信號途徑中關鍵分子的相關抑制劑和RNA干擾等共同處理細胞，以液體閃爍計數法檢測細胞內膽固醇的流出率，Western blotting分別檢測

13、細胞中自噬蛋白LC3和p62的表達，并檢測Class I PI3K和ClassIII PI3K信號途徑各關鍵蛋白的表達。
　　結果：不同濃度的apelin-13（0，1，10，100nM apelin-13）處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞24h后，Western blotting結果顯示，apelin-13濃度依賴性下調Class I PI3K蛋白的表達、下調Akt和mTOR磷酸化和上調PTEN和ULK1蛋白表達；采用PTEN

14、特異抑制劑SF1670處理細胞，結果發(fā)現，與對照組相比，SF1670單獨處理組LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降，上調了p62的表達；與apelin-13組相比，SF1670預處理細胞再加入apelin-13相比，LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降，p62表達上調。液體閃爍計數法檢測結果顯示，與對照組相比，SF1670可減少細胞膽固醇的流出；與單獨用apelin-13處理組的細胞比較，apelin-13與SF1670共處理細胞，可以減少細胞膽固

15、醇的流出；ULK1的siRNA處理細胞后，結果顯示，與Control-siRNA組相比，Control-siRNA加apelin-13共同處理組LC3-Ⅱ/LC3-I比值上調，p62蛋白表達下調；與Control-siRNA加apelin-13共同處理組相比，而ULK1-siRNA組加apelin-13組，LC3-Ⅱ/LC3-I比值顯著下降，p62表達顯著上調，液體閃爍計數法檢測細胞膽固醇的流出率。結果顯示，與Control-siRNA

16、組相比，Control-siRNA加apelin-13共同處理增加細胞膽固醇的流出。與Control-siRNA加apelin-13共同處理組相比，而ULK1-siRNA組加apelin-13組明顯抑制細胞膽固醇的流出。同時結果顯示apelin-13呈劑量依賴性上調了Class III PI3K和Beclin-1表達。Class III PI3K特異抑制劑3-MA處理細胞，結果發(fā)現，與對照組相比，單獨3-MA處理下調 LC3-Ⅱ/LC3

17、-I比值，上調了p62的表達，與apelin-13組相比，與3-MA預處理細胞再加入apelin-13相比，LC3-Ⅱ/LC3-I比值下調，p62上調，液體閃爍計數法檢測細胞膽固醇的流出率。結果顯示，與對照組相比，3-MA可減少細胞膽固醇的流出。與單獨用apelin-13處理組的細胞比較，apelin-13與3-MA共處理細胞，可以減少細胞膽固醇的流出。Beclin-1siRNA處理細胞后，結果顯示，與Control-siRNA組相比，

18、Control-siRNA加 apelin-13共同處理組LC3-Ⅱ/LC3-I比值上調，p62蛋白表達下調；與Control-siRNA加apelin-13共同處理組相比，而Beclin-1-siRNA組加apelin-13組，LC3-Ⅱ/LC3-I比值顯著下降，p62表達顯著上調，液體閃爍計數法檢測細胞膽固醇的流出率。結果顯示，與Control-siRNA組相比，Control-siRNA加apelin-13共同處理增加細胞膽固醇的

19、流出。與Control-siRNA加apelin-13共同處理組相比，而Beclin-1-siRNA組加apelin-13組明顯抑制細胞膽固醇的流出。
　　結論：①apelin-13抑制Class I PI3K信號途徑關鍵蛋白，促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇的流出，減少細胞內膽固醇的蓄積；②apelin-13激活Class III PI3K信號途徑關鍵蛋白表達，促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇的流出，減少細胞

20、內膽固醇的蓄積。
　　第三部分、Apelin-13調控自噬對apoE-/-小鼠膽固醇逆向轉運、動脈壁脂質蓄積和動脈粥樣硬化病變的影響目的：以apoE-/-小鼠為實驗對象進行體內研究，觀察apelin-13對apoE-/-小鼠體內RCT、血脂水平、主動脈壁內脂質蓄積、As病變及自噬水平的影響。初步探討其作用機制。
　　方法：6周齡雄性apoE-/-小鼠隨機分成4組（每組15只），以高脂/高膽固醇（high-fat/high-c

21、holesterol diet，HF/HC，79.5％標準飼料、0.5%膽酸鈉、4%奶粉、2%膽固醇、10%豬油和4%蛋黃粉配制）飼料飼養(yǎng)。其中，對照組（Con group）僅飼以高脂/高膽固醇飲食，隔天腹腔注射與實驗組同等劑量的生理鹽水；apelin-13(APLN group)組除飼以高脂/高膽固醇飲食外，隔天腹腔注射apelin-13（劑量1μg/kg）；PTX+apelin-13組(PTX+APLN group)除飼以高脂/高膽

22、固醇飲食外，隔天腹腔注射PTX（劑量4 mg/kg）4h后再注射apelin-13（劑量1μg/kg）；PTX（PTX group）組除飼以高脂/高膽固醇飲食外，隔天腹腔注射PTX（劑量劑量4mg/kg）。8周后處死動物，體視顯微鏡下觀察血管As形成情況；HE染色觀察主動脈竇處斑塊形成情況；油紅O染色觀察主動脈和主動脈竇As病變處脂質蓄積情況；Masson氏染色法檢測斑塊膠原纖維面積；液體閃爍計數儀測定小鼠腹腔巨噬細胞(mouse pe

23、ritoneal macrophage,MPM)來源的膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transportation,RCT)效率；；全自動生化分析儀檢測甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipopro

24、tein cholesterol,LDL-C）的水平；高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法檢測apoE-/-小鼠腹腔巨噬細胞中脂質水平；Western blot法檢測小鼠主動脈組織和腹腔巨噬細胞內蛋白質的表達。
　　結果：①主動脈體視顯微鏡觀察結果顯示，apelin-13組小鼠主動脈內斑塊較對照組顯著減少，而PTX+apelin-13組小鼠主動脈內斑塊較apeli

25、n-13組顯著增加。②油紅O染色顯示，與對照組相比，apelin-13組小鼠主動脈竇斑塊脂質蓄積明顯減少；與apelin-13組相比，PTX+apelin-13組小鼠的主動脈竇處的病變脂質蓄積明顯增加。③Masson三色染色結果顯示，apelin-13組小鼠主動脈竇病變膠原纖維含量較對照組顯著減少；與apelin-13對照組相比，PTX+apelin-13組小鼠的主動脈竇處的病變膠原纖維含量顯著增加。④液體閃爍計數儀測定各組樣本的3H-

26、膽固醇放射活性。結果發(fā)現，相對于對照組，apelin-13組巨噬細胞來源的膽固醇在血清、肝臟、膽囊及糞便3H-膽固醇含量明顯增多；與apelin-13組相比，PTX+apelin-13組在血清、肝臟膽囊及糞便中3H-膽固醇含量明顯減少。⑤全自動生化分析儀檢測顯示，四組動物的體重、TG及TC均無顯著差異。apelin-13組動物的血漿LDL-C水平較高脂對照組明顯下降，HDL-C水平則升高；PTX+apelin-13組比apelin-13

27、組動物的血漿LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平則下降⑥HPLC結果顯示，與對照組相比，apelin-13組小鼠腹腔巨噬細胞中脂質水平明顯降低；與apelin-13組相比，PTX+ apelin-13組小鼠腹腔巨噬細胞中脂質水平顯著升高，⑦Western blot檢測自噬蛋白結果顯示，與對照組相比，apelin-13組小鼠主動脈 LC3蛋白表達明顯升高、p62蛋白表達明顯降低；與apelin-13組相比，PTX+apelin-13組小

28、鼠主動脈LC3蛋白表達明顯降低、p62蛋白表達明顯升高，⑧Western blot檢測I型PI3K信號通路關鍵蛋白結果顯示，與對照組相比，apelin-13組小鼠主動脈PTEN蛋白表達明顯升高、Class I PI3K蛋白表達明顯降低；與apelin-13組相比，PTX+apelin-13組小鼠主動脈PTEN蛋白表達明顯降低、Class I PI3K蛋白表達明顯升高。并且apelin-13組小鼠主動脈Akt、mTOR磷酸化相對于對照組顯

29、著降低；PTX+ apelin-13組小鼠主動脈Akt、mTOR磷酸化相對于apelin-13組顯著升高。⑨Western blot法檢測Class III PI3K和Beclin-1蛋白表達結果顯示，與對照組相比，apelin-13組小鼠主動脈Class III PI3K和Beclin-1蛋白表達明顯升高；與apelin-13組相比，PTX+apelin-13組小鼠主動脈Class III PI3K和Beclin-1蛋白表達明顯降低。