自噬性磷酸化修飾PAK1-cofilin途徑介導(dǎo)apelin-13促肺腺癌細(xì)胞遷移.pdf

1、目的:
　　本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)apelin-13通過(guò)ERK1/2促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞自噬發(fā)生，然而自噬的作用并不明確，本課題組前期研究以及文獻(xiàn)報(bào)道表明自噬參與細(xì)胞遷移調(diào)控，因此本研究意在探討apelin/APJ對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移的影響以及apelin/APJ誘導(dǎo)的自噬是否參與apelin對(duì)細(xì)胞遷移調(diào)控，闡明apelin/APJ影響肺腺細(xì)胞遷移的自噬-PAK1-cofilin的胞內(nèi)機(jī)制，初步評(píng)估apelin/APJ系統(tǒng)在肺癌轉(zhuǎn)移中

2、的靶標(biāo)作用，為肺癌轉(zhuǎn)移治療提供新的有效靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞遷移檢測(cè)：Wound healing、Transwell
　　2.ELISA:檢測(cè)apelin分泌
　　3.Western blotting:檢測(cè)APJ、p-PAK-1、PAK-1、p-cofilin、cofilin、LC3等相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　4.基因轉(zhuǎn)染：通過(guò)轉(zhuǎn)染，檢測(cè)相關(guān)基因高表達(dá)與低表達(dá)對(duì)細(xì)胞功能的影響
　　5.MTT:研究

3、阿霉素和雷佐生對(duì)A549細(xì)胞活力的影響
　　6.AO/EB染色:熒光染色觀測(cè)阿霉素、雷佐生對(duì)細(xì)胞凋亡影響
　　結(jié)果:
　　1. Apelin-13誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞遷移
　　Transwell結(jié)果顯示apelin-13可以劑量依賴(lài)的促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞遷移，其中0.01μM的apelin-13即可明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移，而0.1μM的apelin-13作用最強(qiáng)。Wound healing證實(shí)0.1μM apelin-13

4、時(shí)間依賴(lài)的促進(jìn)A549細(xì)胞遷移。Transwell和woundhealing進(jìn)一步證實(shí)0.1μM apelin-13顯著誘導(dǎo)肺腺癌大細(xì)胞H460和人高遷移肺腺癌95-D細(xì)胞遷移。
　　2. Apelin-13通過(guò)APJ誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞遷移
　　構(gòu)建含 APJ的重組質(zhì)粒載體 pcMV-Tag2B-APLNR和 APJ的干擾 RNA miR-APLNR-494、miR-APLNR-1712、miR-APLNR-1572序列正確無(wú)突

5、變，熒光拍照結(jié)果提示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功且高效，western blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染空載體pcMT-Tag2B對(duì)A549細(xì)胞APJ表達(dá)無(wú)影響，而pcMV-Tag2B-APLNR轉(zhuǎn)染明顯增加APJ表達(dá)，miR-APLNR-494顯著抑制APJ的表達(dá)，miR-APLNR-1712、miR-APLNR-1572對(duì)APJ表達(dá)無(wú)明顯降低作用。Wound healing顯示，用或者不用apelin-13處理，與空載體轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染pcMV-T

6、ag2B-APLNR促進(jìn)A549細(xì)胞遷移而轉(zhuǎn)染miR-APLNR-494抑制A549細(xì)胞遷移，transwell結(jié)果證實(shí)通過(guò)miR-APNLR-494抑制A549細(xì)胞APJ表達(dá)可以顯著降低apelin-13引起的細(xì)胞遷移。
　　3. Apelin-13誘導(dǎo)PAK1-Cofilin磷酸化促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞遷移
　　應(yīng)用String服務(wù)器對(duì)apelin與PAK1進(jìn)行蛋白蛋白相互作用預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)apelin與PAK1可能存在相互

7、作用。PAK1抑制劑IPA-3處理能夠顯著抑制apelin-13誘導(dǎo)的A549細(xì)胞遷移。而免疫印跡表明apelin-13處理A549細(xì)胞，可時(shí)間依賴(lài)的誘導(dǎo)PAK1和cofilin磷酸化，IPA-3顯著抑制apelin-13誘導(dǎo)的PAK1和cofilin磷酸化，western blot還證實(shí)，apelin-13可以顯著誘導(dǎo)PAK1蛋白表達(dá)，但是對(duì)cofilin表達(dá)無(wú)影響。
　　4.自噬介導(dǎo)apelin-13促肺腺癌A549細(xì)胞遷移<

8、br>　　Apelin-13誘導(dǎo)A549細(xì)胞LC3總蛋白和LC3Ⅱ表達(dá)。自噬抑制劑3-MA能夠抑制apelin-13誘導(dǎo)的LC3Ⅱ生成。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染LC3重組質(zhì)粒后apelin-13孵育，熒光顯微鏡拍照結(jié)果表明apelin-13誘導(dǎo)LC3細(xì)胞膜定位。Transwell結(jié)果證實(shí)自噬抑制劑3-MA可以明顯抑制A549細(xì)胞遷移，并且抑制apelin-13誘導(dǎo)的遷移，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素顯著促進(jìn)A549細(xì)胞遷移，雷帕霉素與apelin合用對(duì)細(xì)

9、胞遷移促進(jìn)作用最強(qiáng)。
　　5.自噬誘導(dǎo)PAK1-cofilin磷酸化介導(dǎo)apelin-13促肺腺癌A549細(xì)胞遷移
　　自噬抑制劑3-MA時(shí)間依賴(lài)的抑制A549細(xì)胞中PAK1磷酸化，并且3-MA抑制apelin誘導(dǎo)的PAK1磷酸化，而自噬抑制劑3-MA同樣時(shí)間依賴(lài)的抑制A549細(xì)胞中cofilin磷酸化，并且抑制apelin-13誘導(dǎo)的磷酸化。
　　6. Apelin-APJ為肺腺癌遷移治療的潛在有效靶標(biāo)
　　M

10、TT分析計(jì)算阿霉素對(duì)A549細(xì)胞的IC50為1.332μM。不同濃度（0.2μM,0.4μM,0.6μM,0.8μM,1μM）的阿霉素處理A549細(xì)胞，AO/EB熒光染色結(jié)果提示低濃度阿霉素并不顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而wound healing結(jié)果提示1μM阿霉素可以明顯抑制A549細(xì)胞遷移，選用1μM阿霉素為實(shí)驗(yàn)濃度。Transwell結(jié)果證明:阿霉素可以顯著抑制A549細(xì)胞遷移，而apelin-13能夠抵消阿霉素的抑制作用，轉(zhuǎn)染pcMV

11、-Tag2B-APLNR的細(xì)胞，阿霉素的作用被逆轉(zhuǎn)，而在轉(zhuǎn)染miR-APLNR-494的細(xì)胞，即使用apelin-13處理，阿霉素也顯著抑制A549細(xì)胞遷移。MTT計(jì)算得出雷佐生的IC50為892.164μM，wound healing顯示10μM的雷佐生即抑制A549細(xì)胞遷移，而AO/EB染色結(jié)果顯示50μM的雷佐生也不引起細(xì)胞凋亡。Transwell結(jié)果證明:10μM雷佐生顯著抑制A549細(xì)胞遷移，而apelin-13能夠廢除阿霉素

12、的抑制遷移作用，轉(zhuǎn)染pcMV-Tag2B-APLNR后A549細(xì)胞遷移明顯增加，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而轉(zhuǎn)染miR-APLNR-494的A549細(xì)胞，即使用apelin-13處理，雷佐生也顯著抑制A549細(xì)胞遷移。
　　7.缺氧誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞APJ表達(dá)和apelin分泌
　　Western blot結(jié)果證實(shí)CoCl2處理A549細(xì)胞制造缺氧模型，可以時(shí)間和劑量依賴(lài)的促進(jìn)A549細(xì)胞APJ表達(dá)，而ELISA結(jié)