磷酸化修飾ataxin-3與自吞噬的關系研究.pdf

1、脊髓小腦型共濟失調Ⅲ型/馬查多-約瑟夫病(SCA3/MJD)，是一種以神經細胞變性、細胞核內蛋白聚集體形成為病理特征的常染色體顯性遺傳病。其致病基因編碼區(qū)含一段異常擴展的CAG三核苷酸重復序，基因編碼產物ataxin-3相應含一段異常擴展的多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)肽鏈。目前包括SCA3/MJD在內的所有polyQ疾病的發(fā)病機制尚不完全清楚，但擴展突變的polyQ蛋白尤其是含polyQ鏈的短降解片段獲得毒性是

2、導致polyQ疾病發(fā)生的最基本原因這點已經取得了大家的共識。研究表明自吞噬參與了降解ataxin-3等polyQ蛋白，藥物誘導自吞噬能明顯緩解擴展突變型polyQ蛋白的細胞毒性。近年研究證實ataxin-3存在多個磷酸化位點，磷酸化修飾ataxin-3參與調控其降解速度、細胞內定位以及形成蛋白聚合體趨勢等，但關于ataxin-3的磷酸化修飾是否參與調節(jié)其被自吞噬降解的效率以及調節(jié)其毒性片段的產生還沒有研究報道，本實驗將從這方面探討磷酸化

3、修飾與自吞噬的關系。
　　 我們擬構建ataxin-3的磷酸化位點缺失突變體(絲氨酸→丙氨酸/S→A)以及擬磷酸化突變體(絲氨酸→天冬氨酸/S→D)的真核表達質粒，通過轉染細胞，用Western blotting檢測蛋白表達水平，以探討磷酸化修飾對ataxin-3在細胞內經自吞噬降解的影響。
　　 目的：探討磷酸化修飾ataxin-3對其通過自吞噬降解的影響。
　　 方法：
　　 1、構建ataxin-3

4、的磷酸化位點缺失和擬磷酸化突變體的真核表達質粒。
　　 2、用自吞噬抑制劑3-MA處理轉染細胞，運用Western blotting檢測各組細胞ataxin-3的表達。
　　 3、用自吞噬激活劑Rapamycin處理轉染細胞，運用Westernblotting檢測各組細胞ataxin-3的表達。
　　 結果：
　　 1、經3-MA抑制自吞噬處理細胞后，無論野生型還是polyQ擴展突變型ataxin-3表達

5、均增加；經Rapamycin誘導自吞噬處理細胞后，野生型和擴展突變型ataxin-3表達均明顯減少。
　　 2、經3-MA抑制自吞噬處理的各組細胞均明顯產生一條短的ataxin-3降解片段。ataxin-3磷酸化修飾對短片段產生無明顯影響。
　　 3、S260D突變后，可以促進ataxin-3蛋白的降解，與Rapamycin有協(xié)同作用；而S260A突變后，對ataxin-3蛋白的降解無明顯影響。
　　 結論：