家蠶后部絲腺轉(zhuǎn)錄組和磷酸化修飾與絲蛋白表達(dá)的關(guān)系研究.pdf

1、家蠶是一種模式昆蟲(chóng)，作為鱗翅目昆蟲(chóng)的典型代表，既具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要體現(xiàn)為絲產(chǎn)業(yè)，而科研價(jià)值也主要集中于利用絲腺作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白，因此，對(duì)于家蠶絲蛋白合成分泌的研究就顯得尤為重要。當(dāng)前，隨著家蠶基因組計(jì)劃的順利完成以及質(zhì)譜等技術(shù)的不斷革新，家蠶領(lǐng)域的研究已經(jīng)進(jìn)入組學(xué)時(shí)代。本次研究就借助了二代測(cè)序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，分別在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的層面，以1對(duì)自行構(gòu)建的繭絲性質(zhì)顯著差異的近等位基因系家蠶(正

2、常結(jié)繭品種IC和裸蛹品種IN)的后部絲腺為材料，探討了絲蛋白合成的表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理;本研究還檢驗(yàn)了基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9對(duì)家蠶基因的變異特征，獲得如下的研究結(jié)果:
　　1.近等位基因系家蠶的構(gòu)建
　　為了更好地研究家蠶絲蛋白合成分泌的分子機(jī)理，本次研究以兩個(gè)家蠶品種Nd和Ps為試驗(yàn)材料，利用多次回交的方法，將裸蛹品種中的Nd基因?qū)氲絇s品種中，最終構(gòu)建了除Nd基因以外，其他遺傳背景基本一致的一對(duì)近等位基因系IC

3、和IN。對(duì)比這一對(duì)近等位基因系的表型差異，結(jié)果表明，兩個(gè)品種的前部絲腺和中部絲腺并無(wú)明顯長(zhǎng)度上的差別，但I(xiàn)N品種的后部絲腺則顯著短于IC品種。此外，在化蛹期間，IC品種的個(gè)體表現(xiàn)為吐絲結(jié)繭，但I(xiàn)N品種不結(jié)繭而直接蛹化，因此，二者在絲產(chǎn)量方面存在顯著性差異。
　　2.差異表達(dá)的mRNA對(duì)絲蛋白合成分泌的調(diào)控機(jī)制
　　以家蠶IC和IN的5齡第3天的后部絲腺為試驗(yàn)材料，利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IN品種中，編

4、碼絲蛋白三種成分以及一些絲膠蛋白的基因表達(dá)水平下調(diào)，這使得絲的產(chǎn)量顯著降低;編碼核糖體蛋白的基因表達(dá)量下降，降低了核糖體的功能，減弱了核糖體的生物學(xué)活性;與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)量減少，導(dǎo)致了絲腺細(xì)胞發(fā)育受到阻礙，從而不能維持正常的形態(tài)來(lái)確保蛋白質(zhì)的合成;能量代謝降低的同時(shí)，裸蛹個(gè)體中的細(xì)胞迅速死亡，表明能量代謝減弱且大部分作用于細(xì)胞自身發(fā)育，從而導(dǎo)致絲蛋白合成代謝過(guò)程中能量供應(yīng)不足。此外，編碼絲素酶的基因顯著上調(diào)，也導(dǎo)致了絲素蛋白被大

5、量降解，絲蛋白的產(chǎn)量隨之降低。
　　3.差異表達(dá)的miRNA對(duì)絲蛋白合成分泌的調(diào)控機(jī)制
　　miRNAs是存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類(lèi)內(nèi)源性單鏈小分子RNA，對(duì)生物個(gè)體的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控起到關(guān)鍵的作用。利用RNA-seq的技術(shù)，我們系統(tǒng)性地比較了兩個(gè)品種的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在IN中miRNAs數(shù)量要明顯多于IC品種，進(jìn)一步對(duì)miRNAs進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，影響絲蛋白合成分泌的miRNAs主要作用于以下幾個(gè)方面:參與調(diào)控絲蛋白的

6、主要成分以及調(diào)節(jié)絲蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，抑制編碼絲蛋白基因的表達(dá);參與細(xì)胞周期調(diào)控，影響絲腺細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致絲蛋白合成分泌的場(chǎng)所發(fā)育不健全;參與能量代謝調(diào)控，裸蛹體內(nèi)的能量合成降低，且更多的能量作用于個(gè)體的發(fā)育而不是蛋白質(zhì)的合成。
　　4.蛋白質(zhì)的差異磷酸化水平對(duì)絲蛋白合成分泌的調(diào)控機(jī)制
　　利用質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了兩個(gè)品種后部絲腺的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，獲得了家蠶的蛋白質(zhì)磷酸化特征，即家蠶的肽段或者蛋白均主要發(fā)生

7、單一磷酸化事件，且磷酸化事件主要由acidic和proline-directed兩類(lèi)激酶進(jìn)行催化，同時(shí)，絲氨酸為家蠶中最多被磷酸化的位點(diǎn)，其次為蘇氨酸和酪氨酸。磷酸化修飾對(duì)于絲蛋白合成分泌的調(diào)控主要包括:下調(diào)翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化水平，影響蛋白的產(chǎn)量;下調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白積累，影響新蛋白的合成和功能的行使;增加能量代謝，但由于個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育迅速，作用于蛋白質(zhì)合成的能量消耗減少;下調(diào)絲素重鏈蛋白的磷酸化，阻礙了

8、絲蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成并抑制了絲蛋白分泌到絲腺腔這一生物學(xué)過(guò)程。
　　5.CRISPR/Cas9技術(shù)引導(dǎo)的家蠶基因變異特征
　　CRISPR/Cas9技術(shù)可以在家蠶中介導(dǎo)高效率的基因突變，且突變特異性較好，合理選擇靶位點(diǎn)后，不容易產(chǎn)生脫靶現(xiàn)象。對(duì)突變后的個(gè)體進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)如下結(jié)果:G0代中的一些突變可能發(fā)生于體細(xì)胞中，從而造成該部分變異不能遺傳給后代;基因型變化并不等同于表型變化，在突變的個(gè)體中，有可能會(huì)發(fā)生無(wú)義突變的現(xiàn)象，使

9、得表型改變率低于基因變異率。這些結(jié)果提示對(duì)于突變效率的統(tǒng)計(jì)，需要同時(shí)檢測(cè)G0代和G1代，同時(shí)，對(duì)于一些具有表型變化的基因，既根據(jù)表型改變進(jìn)行篩選，也應(yīng)結(jié)合測(cè)序技術(shù)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的基因型，以免造成突變個(gè)體的遺失。此外，為了獲得突變體，合適的靶點(diǎn)、未污染的mRNA、恰當(dāng)?shù)淖⑸鋾r(shí)間等都是比較關(guān)鍵的方面。
　　綜上所述，本研究首先構(gòu)建了結(jié)繭(IC)和裸蛹(IN)的1對(duì)近等位基因系家蠶，以這2個(gè)品種為研究對(duì)象，從mRNA、miRNA、磷酸化蛋白質(zhì)