家蠶蛻皮激素受體和超氣門蛋白在絲腺中的表達(dá)特征及其相關(guān)功能研究.pdf

1、20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）是調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程的重要激素。蛻皮激素受體(Ecdysone receptor，EcR)和超氣門蛋白（Ultraspiracle，USP）組成的異源二聚體是昆蟲(chóng)20E的靶標(biāo)。20E通過(guò)該異源二聚體誘導(dǎo)下游靶標(biāo)基因的表達(dá)并傳遞20E信號(hào)。本文通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了20E處理后體內(nèi)和體外離體培養(yǎng)條件下EcR和USP基因在家蠶絲腺中的表達(dá)水平;分別克隆了家蠶蛻皮激素受體結(jié)構(gòu)

2、域EcR-B1D和超氣門蛋白結(jié)構(gòu)域USPD，并構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行了純化;采用等溫量熱滴定技術(shù)（ITC技術(shù)）檢測(cè)了蛻皮激素受體結(jié)構(gòu)域蛋白EcR-B1D與蛻皮激素響應(yīng)元件E75A-EcRE及其缺失突變體的結(jié)合反應(yīng)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、?0E處理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因在家蠶絲腺組織中的表達(dá)。20E處理后BmEcR-A、BmEc R-B1和Bm USP基因在家

3、蠶中、后部絲腺的表達(dá)相比對(duì)照組均有不同程度增加，表明20E能夠促進(jìn)更多BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達(dá)。但中部絲腺和后部絲腺BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達(dá)趨勢(shì)并不相同。
　?、企w外培養(yǎng)絲腺組織在20E處理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達(dá)。離體培養(yǎng)絲腺組織經(jīng)20E處理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達(dá)相比于對(duì)照組均增加，并與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本

4、一致。在20E和JHⅢ共處理?xiàng)l件下，BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達(dá)均上調(diào)，且強(qiáng)于20E單獨(dú)處理組，這一現(xiàn)象在中部絲腺表現(xiàn)更為顯著，表明JHⅢ在一定條件下能增強(qiáng)EcR和USP的表達(dá)。
　?、峭懫ぜに厥荏w結(jié)構(gòu)域BmEcR-B1D和超氣門蛋白結(jié)構(gòu)域BmUSPD的原核表達(dá)。分別克隆得到家蠶蛋白結(jié)構(gòu)域序列EcR-B1D和USPD。家蠶EcR-B1D長(zhǎng)度為786bp，編碼261個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為29.66

5、 kDa，等電點(diǎn)約為5.23;家蠶USPD長(zhǎng)度為798bp，編碼265個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為29.76kDa，等電點(diǎn)約為5.75。將BmEcR-B1D和BmUSPD克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)成功進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)并純化。
　?、菳mEcR-B1 D與BmE75A-EcRE及其缺失突變體的結(jié)合反應(yīng)。在體外條件下通過(guò)等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)獲得了BmE

6、cR-B1D蛋白與BmE75A-EcRE及其缺失突變體相互作用的一系列熱力學(xué)參數(shù)包括親和力常數(shù)(K)、反應(yīng)熱(△H)和熵(△S)。結(jié)果表明BmEcR-B1D蛋白能夠與BmE75A-EcRE進(jìn)行結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)了BmE75A-EcRE的核心保守區(qū)為TCTTC。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析20E誘導(dǎo)下體內(nèi)和體外家蠶絲腺組織中BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)20E均可上調(diào)上述三種基因的表達(dá)水平;通過(guò)原核表達(dá)BmEcR-B1D和BmU