家蠶S期激酶相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能研究.pdf

1、最初發(fā)現(xiàn)Skp(S-phas.Kinas.associate.Protein)蛋白與cyclinA-CDK復(fù)合物在細(xì)胞S期相互作用，故稱為S期激酶相關(guān)蛋白。它是F-box蛋白的一種，參與生物的泛素化過程。目前Skp蛋白在許多動(dòng)植物中都有發(fā)現(xiàn)，尤其在人類的許多癌癥中都有研究。但在家蠶中尚未有報(bào)道。Skp蛋白中研究較多的是Skp2蛋白，Skp2以細(xì)胞周期依賴的形式在G晚期開始出現(xiàn)，S/G期高表達(dá)，然后其mRNA和蛋白水平迅速下降。目前研究表

2、明Skp2的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平雙重調(diào)節(jié)，且在不同類型的細(xì)胞中起主導(dǎo)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制不同。
　　 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶cDNA文庫中獲得一條基因序列，經(jīng)NCBI序列比對后推測是家蠶S期激酶相關(guān)蛋白，并命名為BmSkp。該基因ORF共59.bp，無內(nèi)含子，編碼198個(gè)氨基酸。Blastp比對結(jié)果表明BmSkp蛋白包含3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域Skpl，預(yù)測蛋白分子量為22.32.kD，等電點(diǎn)為4.40，是一個(gè)酸性親水性蛋白。將BmSkp基因插

3、入到pET-28a的Eco.I和Xh.I兩個(gè)酶切位點(diǎn)間，得到融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BmSkp。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，活化重組菌，用終濃度為1 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在2.kD左右發(fā)現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與目的蛋白大小相符(His-tag為3.5.kD，BmSkp預(yù)測為22.32.kD)。我們采用鎳柱親和層析的方法純化目的蛋白。以純化所得高純度蛋白為抗原免疫雄性新西蘭大白兔，

4、制備該重組蛋白的多克隆抗體，ELISA檢測該抗血清的效價(jià)可達(dá)到1：21800以上，免疫印跡檢測表明抗體有較高的特異性，說明抗體有效，可以進(jìn)行下一步相關(guān)免疫實(shí)驗(yàn)。提取家蠶各發(fā)育時(shí)期和五齡幼蟲各組織的總RNA和總蛋白，分別用熒光定量PCR和Wester.blotting技術(shù)檢測BmSkp蛋白在家蠶中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BmSkp基因在家蠶四個(gè)發(fā)育時(shí)期中的轉(zhuǎn)錄情況存在較大差異，其中，蛾中最高，卵中最低。在家蠶五齡幼蟲各組織中的轉(zhuǎn)錄