家蠶吡哆醋激酶基因的表達(dá)分析.pdf

1、維生素B6(VitaminB6，VB6)為水溶性維生素，是一類吡啶化合物的總稱，游離型有吡哆醛(Pyridoxal，PL)、吡哆醇(Pyridoxine，PN)和吡哆胺(Pyridoxamine，PM)，相應(yīng)磷酸酯形式為磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)、磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate，PNP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate，PMP)。其中PL

2、P是VB6的主要輔酶形式，參與氨基酸代謝的各種反應(yīng)。吡哆醛激酶（pyridoxalkinase，PLK）是VB6 關(guān)鍵代謝酶，在二價(jià)金屬陽(yáng)離子和ATP 存在下，催化游離形式VB6 各自磷酸化反應(yīng)，生成相應(yīng)的磷酸酯型，并且與磷酸吡哆醇氧化酶、磷酸酶一起維持細(xì)胞內(nèi)PLP 濃度的動(dòng)態(tài)平衡。
　　 我們的前期研究采用生物信息學(xué)原理和PCR方法，構(gòu)建家蠶PLK 融合基因表達(dá)質(zhì)粒pET22b-His-PLK，原核表達(dá)純化出重組蛋白，并且分析

3、了家蠶PLK的基本酶學(xué)性質(zhì)，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了預(yù)測(cè)。
　　 本研究在此基礎(chǔ)上將融合質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)親和層析純化，以純化的蛋白為抗原免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)可達(dá)到1：51200以上。提取家蠶五齡幼蟲(chóng)的各組織蛋白，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLK在家蠶的精巢、馬氏管、中腸、表皮、頭部等組織中都有表達(dá)，且表達(dá)量依次降低，而在絲腺中沒(méi)有明顯檢測(cè)到該蛋白的存在。我們還利用熒光

4、定量PCR的方法，對(duì)家蠶五齡幼蟲(chóng)各組織中的mRNA的量進(jìn)行了比較。通過(guò)從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平研究PLK基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期及幼蟲(chóng)不同組織中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)情況，明確了PLK在家蠶5齡期不同組織中的功能，為進(jìn)一步探討PLK在家蠶VB6代謝中的生物學(xué)功能提供重要依據(jù)。
　　 家蠶既是用于蠶絲生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)作物，也是僅次于果蠅作為昆蟲(chóng)研究的模式生物，同時(shí)還是開(kāi)發(fā)新一代生物反應(yīng)器和新型昆蟲(chóng)產(chǎn)業(yè)的材料。家蠶在生長(zhǎng)發(fā)育和合成絲蛋白時(shí)，體內(nèi)