家蠶解毒酶基因表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、在自然界中，生物體不斷地與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，以滿足自身的生長、發(fā)育和生存需要。在這些物質(zhì)中，有些是為了滿足生物體營養(yǎng)所需，對生物體是有益的；有些卻對生物體的生命有危害。為了生存，生物體必須具備一定的生理、生化，甚至是行為適應(yīng)能力。通過體內(nèi)的解毒酶系統(tǒng)催化分解代謝產(chǎn)物或異源物，起到解毒作用，是生物體主要且常見的一種適應(yīng)機(jī)制。昆蟲的解毒酶是一類異質(zhì)酶系，能夠代謝大量的內(nèi)源或外源底物，這些解毒酶系包括：細(xì)胞色素P450酶系、谷胱甘肽-S-

2、轉(zhuǎn)移酶系和酯酶等。
　　應(yīng)用geNorm和NormFinder軟件首先對內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析以選擇相對較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，是相對定量過程中比較關(guān)鍵的步驟，然而即使選擇了相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因，由內(nèi)參不穩(wěn)定帶來的誤差仍是不容忽視的。而Dual spike-in qPCR通過向樣品中加入外參基因，對目標(biāo)基因進(jìn)行全程跟蹤標(biāo)定，使校正結(jié)果較為準(zhǔn)確。但是，該方法需同時(shí)測定DNA和RNA，使得該方法的工作量提高一倍，增加了實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。為了解決

3、這一問題，我們設(shè)想以Dual spike-in qPCR首先對已標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參基因進(jìn)行定量，再以此內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正的新的實(shí)驗(yàn)思路，結(jié)果表明該方法在能得到較準(zhǔn)確定量結(jié)果的同時(shí)，降低了實(shí)驗(yàn)的工作量和成本，為實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了新的參考。
　　為了從宏觀上解析家蠶體內(nèi)主要解毒酶基因的分布情況以及外源物質(zhì)對解毒酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，我們采用Dual spike-in qPCR方法，測定了家蠶正常情況以及分別添

4、食蛻皮激素和蕓香苷條件下各組織中主要解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：中腸中參與蛻皮激素代謝的基因相對較少，BmGST基因主要參與了中腸對蕓香苷的代謝。脂肪體中參與蛻皮激素代謝的基因主要有CYP9a20, BmGSTo1, BmGSTz2等；參與蕓香苷代謝的基因較多，以BmGST基因?yàn)橹?。馬氏管中參與蛻皮激素代謝的基因主要有CYP6ab4, BmGSTs2, BmCarE15等；參與蕓香苷代謝的基因主要有BmGSTo1。
　　為進(jìn)一

5、步了解家蠶解毒酶基因的生理功能，本研究選擇了三個(gè)主要解毒酶基因：CYP6ab4、BmGSTd1、BmCarE-10。對上述基因設(shè)計(jì)了3個(gè)不同位點(diǎn)的siRNA，通過轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞的方法篩選出干擾效果最顯著的siRNA片段。結(jié)果表明：CYP6ab4-928，BmGSTd1-405，BmCarE-10-519的干擾效果最為顯著，分別使各自干擾基因的轉(zhuǎn)錄水平下降到對照的26.5%，39.6%和17.9%，可用于進(jìn)一步的體內(nèi)RNAi實(shí)驗(yàn)。對家蠶五

6、齡幼蟲注射有效干擾siRNA片段，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定并分析經(jīng)RNAi后家蠶解毒酶基因在中腸、脂肪體和馬氏管3種組織中轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明：家蠶五齡幼蟲通過注射siRNA，3種被測基因表達(dá)都能夠被成功抑制，且注射后48h比24h效果更為明顯。為了解家蠶解毒酶基因RNAi后蟲體對辛硫磷的抗性差異，對家蠶5齡幼蟲分別注射siRNA片段后，添食浸有辛硫磷的桑葉，調(diào)查統(tǒng)計(jì)了不同處理下的累積致死率。結(jié)果顯示：分別注射三個(gè)解毒酶基因siR

7、NA48h后添食辛硫磷導(dǎo)致的蟲體死亡率顯著增高，分別達(dá)到88%、84%和89%。
　　為研究家蠶主要解毒酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對三個(gè)主要解毒酶基因：CYP6ab4、BmGSTd1、BmCarE-10的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了功能分析，構(gòu)建了含熒光素酶報(bào)告基因和啟動(dòng)子不同長度順次缺失片段的重組質(zhì)粒，與內(nèi)參載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明：蛻皮激素能夠上調(diào)CYP6ab4和BmGSTd1基因

8、啟動(dòng)子的活性，而蕓香苷能夠上調(diào)BmGSTd1和BmCarE-10基因啟動(dòng)子的活性。家蠶CYP6ab4基因啟動(dòng)子5'單側(cè)-827~-722bp是該基因啟動(dòng)子的主要活性區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)存在的BR-CZ可能在基因表達(dá)調(diào)控過程中起重要作用；BmGSTd1基因啟動(dòng)子5'單側(cè)-1385~-1299bp區(qū)域內(nèi)存在的Kr可能參與了基因的表達(dá)調(diào)控；BmCarE-10基因的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域是啟動(dòng)子5'單側(cè)-705~-625bp，該區(qū)域內(nèi)存在的Sn可能參與了基因的

9、表達(dá)調(diào)控。
　　為了利用rAcMNPV作為基因介導(dǎo)的載體的雙熒光定量表達(dá)載體系統(tǒng)對家蠶解毒酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的功能進(jìn)行分析。我們構(gòu)建一個(gè)FHNLuc-A3RL雙熒光質(zhì)粒，其中螢火蟲熒光素酶（FLuc）基因由解毒酶基因啟動(dòng)子帶動(dòng)，另一個(gè)由家蠶actin3啟動(dòng)子控制的海腎熒光素酶（RLuc）作內(nèi)參基因。通過Bac-to-Bac系統(tǒng)制備重組桿狀病毒，將這些重組病毒分別注射感染五齡起蠶，測定熒光素酶活性，從而分析啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明：無論是

10、在正常狀態(tài)下還是在外源物質(zhì)誘導(dǎo)下，各基因啟動(dòng)子在馬氏管和脂肪體組織中的活性均高于其它組織，再次表明這兩個(gè)組織在外源物質(zhì)代謝過程中的重要性。而且其活性區(qū)域與BmN細(xì)胞中的測定結(jié)果基本一致，也再次證明了各活性區(qū)域內(nèi)可能存在與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的作用元件。
　　本研究通過定量PCR從宏觀上分析了家蠶解素酶轉(zhuǎn)錄水平的基本情況；并通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析了三個(gè)重要解毒酶基因的啟動(dòng)子序列，得到了其中重要的調(diào)控區(qū)域，以及相關(guān)的蛋白因子。為家