白腐真菌漆酶基因表達(dá)調(diào)控及其功能研究.pdf

1、白腐真菌依賴于一系列的木質(zhì)素降解酶系，能夠高效地對(duì)各種天然木質(zhì)纖維素及人工合成化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行非專一性的降解。其中一種含銅的多酚氧化酶：漆酶（Laccase）是白腐真菌降解木質(zhì)素的重要酶類，具有廣泛的底物作用范圍及重要的生物降解功能，在木質(zhì)素降解與生物質(zhì)能源底物的獲取、難降解環(huán)境污染物等異生物質(zhì)的降解、染料脫色、造紙工業(yè)中的紙漿去木質(zhì)化、食品加工等領(lǐng)域都具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和潛能。因此，漆酶基因資源的獲取、生理功能及其表達(dá)調(diào)控的研究對(duì)于豐富白

2、腐真菌分子生物學(xué)理論及完善相關(guān)生物技術(shù)手段極其重要?；诖?，本論文緊密圍繞白腐真菌重要的木質(zhì)素降解酶漆酶開(kāi)展了一系列的分子生物學(xué)研究，主要研究結(jié)果如下：
　　利用簡(jiǎn)并引物PCR和TAIL-PCR等基因組步行技術(shù)以及RT-PCR技術(shù)，從一株漆酶活性高、能夠降解不同結(jié)構(gòu)染料的白腐真菌菌株Trametes sp.48424中克隆獲得一個(gè)漆酶基因lac48424-1及其全長(zhǎng)cDNA序列。利用SEFA-PCR等基因組步移技術(shù)克隆得到lac4

3、8424-1漆酶基因啟動(dòng)子上游調(diào)控序列，預(yù)測(cè)有多個(gè)可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用DNA調(diào)控元件。成功實(shí)現(xiàn)了lac48424-1漆酶基因在畢赤酵母中的異源表達(dá)，驗(yàn)證了lac48424-1漆酶基因能夠編碼有活性的漆酶蛋白。
　　從成功表達(dá)lac48424-1漆酶基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中純化得到酵母重組漆酶蛋白rLAC48424-1，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)以及降解不同結(jié)構(gòu)染料和模擬染料廢水的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明重組漆酶rLac48424-1具有優(yōu)良

4、的酶學(xué)性質(zhì)。相比于某些已報(bào)道的其它漆酶，rLac48424-1具有更好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，重組漆酶rLac48424-1在50℃放置1小時(shí)后，相對(duì)酶活仍有88.0％，rLac48424-1在pH=5條件下保存7天，相對(duì)酶活仍有87.6％。重組漆酶rLac48424-1對(duì)多種有機(jī)溶劑如乙腈、丙酮、甲醇、乙醇等具有較強(qiáng)的耐受性。rLac48424-1對(duì)不同結(jié)構(gòu)的染料和模擬染料廢水具有更強(qiáng)的脫色降解能力。小分子介體丁香醛可以有效提高rLa

5、c48424-1對(duì)某些難降解染料的降解能力。
　　深入研究了在畢赤酵母中異源表達(dá)的漆酶基因參與畢赤酵母抵抗氧化脅迫的生物學(xué)功能及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于白腐真菌的漆酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)可以顯著增強(qiáng)酵母細(xì)胞抵抗過(guò)氧化氫介導(dǎo)的氧化脅迫的能力。進(jìn)一步研究表明：外源過(guò)氧化氫誘發(fā)的氧化脅迫能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)白腐真菌漆酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)，而漆酶基因的表達(dá)能夠誘導(dǎo)激活酵母谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而通過(guò)有效提升酵母細(xì)胞谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)

6、的水平（包括胞內(nèi)谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性、谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和谷胱甘肽還原酶活性等）來(lái)增強(qiáng)酵母細(xì)胞抵抗氧化脅迫的能力。
　　根據(jù)漆酶基因lac48424-1啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域存在的不同順式作用元件（如：金屬離子響應(yīng)元件MRE、異生物質(zhì)響應(yīng)元件XRE等）的預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)了一系列的誘導(dǎo)物，研究了這些不同誘導(dǎo)物和環(huán)境因素對(duì)Trametes sp.48424漆酶基因lac48424-1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。結(jié)果表明不同金屬離子、多

7、種芳香化合物、不同木素等對(duì)漆酶基因lac48424-1的轉(zhuǎn)錄具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)增強(qiáng)作用，不同因素對(duì)漆酶基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)調(diào)控可能與不同順式作用調(diào)控元件有關(guān)。
　　綜上所述，本論文不僅成功實(shí)現(xiàn)了白腐真菌漆酶基因的異源表達(dá)及活性蛋白功能驗(yàn)證，而且發(fā)現(xiàn)了漆酶基因的表達(dá)能夠通過(guò)有效提升酵母細(xì)胞谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)水平來(lái)增強(qiáng)抗氧化脅迫的能力。對(duì)白腐真菌漆酶基因上游調(diào)控元件的預(yù)測(cè)及多種因子可調(diào)控lac48424-1漆酶基因轉(zhuǎn)錄的研究結(jié)果，為進(jìn)一步深入研