白腐菌漆酶的制備、催化聚合的研究及漆酶基因克隆的初探.pdf

1、漆酶(EC1.1.0.32，對(duì)苯二酚：氧氧化還原酶)是一種含多個(gè)銅原子的多酚氧化酶，具有較高的氧化還原電位，能催化氧化多種芳香類化合物，在環(huán)境保護(hù)、制漿造紙、食品加工、有機(jī)合成等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以漆酶的高效生產(chǎn)為目標(biāo)，對(duì)漆酶高效產(chǎn)生菌株Trametes hirsuta BYBF進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)、漆酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)、漆酶在氯酚類廢水中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究和分析，并對(duì)此漆酶基因的克隆進(jìn)行了初探。
　　

2、氣升式生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡單、反應(yīng)啟動(dòng)快、氧傳質(zhì)效率高、剪切力小，利用菌絲球在流化床內(nèi)產(chǎn)漆酶，可以使菌絲球、發(fā)酵液和氧氣得到充分接觸，能大大加快白腐菌產(chǎn)漆酶的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)室擬采用自己設(shè)計(jì)的2.5L三相流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行產(chǎn)酶研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在通氣量是3.0L/min，接種量是10％的條件下，發(fā)酵五天后酶活即可達(dá)到3.36IU/mL，與搖瓶發(fā)酵相比（1.58IU/mL），不僅縮短了產(chǎn)酶周期，而且酶活也得到了大幅度的提高，大大提高了產(chǎn)酶效

3、率和產(chǎn)酶量。利用流化床生物反應(yīng)器還可對(duì)菌絲球進(jìn)行重復(fù)分批發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)表明Trametes hirsuta BYBF菌絲球至少可以重復(fù)發(fā)酵五次，漆酶產(chǎn)率均在0.5 IU/(mL·d)以上。該工藝不僅節(jié)省了液體菌種的培養(yǎng)時(shí)間和消耗，而且減少了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，為漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 通過離心、過濾收集白腐菌Trametes hirsuta BYBF的發(fā)酵液即得粗酶液，然后通過硫酸銨沉淀、透析濃縮、DEAE-Sep

4、harose 陰離子層析柱和SephadeXG-100分子篩層析對(duì)所得粗漆酶進(jìn)行了分離純化，得率是8.9％，純化倍數(shù)是10.2，純化后得到的漆酶經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)為單一蛋白，并與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較得到此漆酶的表觀分子量為33.9KDa。以ABTS為底物時(shí)，酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別是55℃和4.5。此酶具有較好的溫度和pH穩(wěn)定性，基本能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)酶的要求。
　　 此外，還以愈創(chuàng)木酚和ABTS為底物對(duì)漆酶的反應(yīng)動(dòng)力性進(jìn)行了

5、研究，以愈創(chuàng)木酚為底物時(shí)，Km和Vmax分別是1.32 mmol/L和4.5×10-6 mol/L﹒min，以ABTS為底物時(shí)，Km和Vmax分別是0.032mmol/L和8.7×10-6 mol/L﹒min，所以漆酶對(duì)ABTS具有較大的反應(yīng)活性。在最佳的反應(yīng)條件下，我們研究了濃度為2mmol/L無機(jī)元素對(duì)酶活性的影響：Fe3+、Ag+、Mn2+對(duì)酶活性具有抑制作用，Mg2+、Cl-、Na+、Ca2+對(duì)酶活影響不大，而Cu2+、Al3+

6、、Zn2+能明顯提高漆酶的活性，其中Cu2+對(duì)提高漆酶活性提高幅度最大。
　　 制漿造紙工業(yè)中氯漂廢水中含有大量的氯代酚及其衍生物，這類有毒物質(zhì)排放到環(huán)境中嚴(yán)重威脅著生態(tài)平衡。本研究以2,4-二氯苯酚（簡稱2,4-DCP）為氯酚類化合物的模型物，在曝氣的條件下，研究白腐菌Trametes hirsuta BYBF產(chǎn)漆酶對(duì)2,4-DCP的去除效果：研究發(fā)現(xiàn)2,4-DCP的去除率隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增大，在適宜的條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?

7、0mM/L時(shí)，曝氣20h后去除率就可以達(dá)到93.6％。此外,2,4-DCP的去除效果也受到反應(yīng)體系的溫度、pH值等因素的影響，在溫度和pH是25℃-45℃和pH4-6范圍內(nèi)是具有較好的去除效果。在最適條件下曝氣20h，純化漆酶和粗漆酶液對(duì)2,4-DCP的去除率分別為84.9％和93.6％，這就說明純化漆酶要比粗酶液處理酚類物質(zhì)的效果要差一些。
　　 最佳條件下，在漆酶的作用下曝氣10h，經(jīng)蛋白酶和水洗處理后，測(cè)得聚合物的分子量為

8、2838（二氯代酚的分子量為163），可見漆酶對(duì)2,4-DCP有很好的催化聚合作用。用紅外和13C-NMR對(duì)處理后的聚合產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，產(chǎn)物是帶有酚羥基的高分子聚合產(chǎn)物，并且聚合產(chǎn)物上的苯環(huán)在漆酶的作用下會(huì)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生帶羧基的脂肪族側(cè)鏈。推測(cè)其催化聚合反應(yīng)機(jī)理可能是首先生成酚氧游離基，游離基之間相互結(jié)合生成二聚體或三聚體，然后發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步脫氯生成相對(duì)穩(wěn)定的低分子聚合物，低分子聚合物之間也能發(fā)生脫氯聚合生成高聚物，最后高

9、分子聚合物中部分苯環(huán)會(huì)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，生成羧酸類物質(zhì)。此外，底物之間還能發(fā)生交叉偶聯(lián)，生成復(fù)雜的交聯(lián)產(chǎn)物，這樣就可以使有毒的酚生成疏水性高聚物通過沉淀而除去。
　　 此外，還成功地用CTAB法提取了此白腐菌的DNA，提取RNA并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖譜表明分離得到了高純度的DNA和RNA，滿足了分子生物學(xué)對(duì)基因片段的要求，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)計(jì)并合成了漆酶基因的簡并引物，通過RT-PCR的方法成功擴(kuò)增了漆酶的基因，并分析確定克隆