漆斑菌屬膽紅素氧化酶的純化、分析及基因克隆.pdf

1、膽紅素氧化酶(BOD)是一種催化膽紅素生成膽綠素和其它物質(zhì)的一種酶.一些膽紅素氧化酶已從疣孢漆斑菌和微紫青霉等生物體中被分離純化出來(lái).該研究對(duì)漆斑菌屬的疣孢漆斑菌和三種露濕漆斑菌進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),加入26×<'-4>%的誘導(dǎo)劑(CuSO<,4>)可很大程度地提高這四種菌BOD的活性.我們從漆斑菌屬的四種菌中分離純化出了膽紅素氧化酶,純化過(guò)程中陽(yáng)離子交換樹(shù)脂代替活性碳、低溫、甘油都有助于酶活的保持.與疣孢漆斑菌BOD相比較,露濕漆

2、斑菌3.1967BOD的分子量、膽紅素-聚丙烯酰胺凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶、糖染結(jié)果、等電點(diǎn)、純化條件等都不相同.這說(shuō)明露濕漆斑菌3.1967BOD是不同于疣孢漆斑菌BOD的一種酶.在BOD的鑒定過(guò)程中膽紅素平板、膽紅素-聚丙烯酰胺凝膠電泳、糖染與銀染結(jié)合法是未被報(bào)導(dǎo)過(guò)的新方法,這些方法的應(yīng)用對(duì)于BOD的鑒定很有幫助.該實(shí)驗(yàn)對(duì)BOD的測(cè)定方法也有所改進(jìn),以露濕漆斑菌3.1967BOD各種性質(zhì)作根據(jù),在酶的最適反應(yīng)條件下(37℃、

3、pH8.1)進(jìn)行反應(yīng),膽紅素有最大吸收峰的波長(zhǎng)440nm下測(cè)定OD值.以抗壞血酸和EDTA作為反應(yīng)終止劑將反應(yīng)終止在特定的時(shí)間,使酶活測(cè)定不用恒溫分光光度計(jì),而只用普通的分光光度計(jì)就可測(cè)定,這也將有助于膽紅素酶法測(cè)定的推廣和應(yīng)用.根據(jù)Genebank中疣孢漆斑菌膽紅素氧化酶(MV BOD)基因的編碼序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR從疣孢漆斑菌的染色體DNA中擴(kuò)增得到了1937bp的基因,將其克隆到T載體中,構(gòu)建成重組質(zhì)粒,并對(duì)其測(cè)序,通過(guò)測(cè)序驗(yàn)