Kurthia huakuii漆酶基因的克隆表達(dá)、蛋白純化與酶學(xué)特性研究.pdf

1、漆酶由于能夠催化氧化各種酚類(lèi)和非酚類(lèi)芳香化合物成水，漆酶被廣泛用于合成染料的脫色和脫毒。Kurthia屬菌株對(duì)三苯甲烷染料和紡織染料廢水具有出色的脫色性能。根據(jù)Kurthia huakuii LAM0618T基因組注釋的結(jié)果，并基于生物信息學(xué)的分析，本文克隆了一個(gè)類(lèi)漆酶基因laclK，并對(duì)laclK的原核表達(dá)，重組LaclK的酶學(xué)特性及其在染料脫色方面開(kāi)展了一系列研究。主要結(jié)論如下：
　?。?）成功構(gòu)建了E.coli BL21(D

2、E3)/pET28a-laclK表達(dá)菌株。
　?。?）通過(guò)IPTG、銅離子以及溫度梯度誘導(dǎo)，確定了LaclK誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件，為0.2 mM IPTG和0.5 mM Cu2+低溫16℃誘導(dǎo)。咪唑梯度洗脫確定了重組LaclK最佳的洗脫濃度，為300 mM。
　　（3）結(jié)構(gòu)性質(zhì)：光譜學(xué)分析表明LaclK在610 nm和330 nm處未出現(xiàn)漆酶特征吸收峰。銅含量測(cè)定表明LaclK只含有1個(gè)銅離子。
　　（4）酶學(xué)特性：La

3、clK最適反應(yīng)溫度為65℃，60℃、pH2.5條件下保持6 d酶活無(wú)損失，80℃半衰期83 h。LaclK是發(fā)現(xiàn)最耐熱的酚氧化酶類(lèi)。LaclK能夠催化常見(jiàn)漆酶底物ABTS、2,6-DMP和L-多巴胺。以ABTS、2,6-DMP、L-多巴胺為底物時(shí)最適pH分別為2.5、7.0和6.0。LaclK在酸性條件下和中性偏堿性條件下（pH2.0~9.0）都具有酶活，尤其在酸性條件下（pH2.5）具有很高的穩(wěn)定性。銅離子對(duì)LaclK發(fā)揮酶活性是必要

4、的，0.2 mM的Cu2+濃度使LaclK酶活達(dá)到最高。1 mmol的Mg2+, Pb2+, K+, Co2+和Ca2+能促進(jìn)酶活，而1 mmol的Mn2+，F(xiàn)e2+，Zn2+和Ag+對(duì)LaclK具有抑制作用。LaclK具有很好的有機(jī)試劑耐受能力，10％（v/v）的甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、曲拉通X-100和二甲基亞砜都能促進(jìn)酶活。L-Cys、EDTA、DTT以及SDS是酶的強(qiáng)抑制劑。LaclK的催化常數(shù)Kcat與某些報(bào)道的多銅氧化酶很