29480.漆酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其酶的分離純化、性質(zhì)和基因克隆研究

1、Y959355分類號(hào)Q222：22tide學(xué)位論文密級(jí)學(xué)導(dǎo)BOl0103漆酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其酶的分離純化、性質(zhì)和基因克隆研究指導(dǎo)教師申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別論文提交El期黃乾明楊婉身教授(四川農(nóng)業(yè)大學(xué))謝君教授(華南農(nóng)業(yè)大學(xué))!蔓2006年5月學(xué)位授予單位：旦叫壅些盔堂專業(yè)名稱：生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文答辯日期：2Q塑壘縣學(xué)位授予目期：2Q壘璺壘2目答辯委員舍主席：毯豎垂茲授評(píng)閱人：王=]l教授陳宏佳教授位吐面數(shù)授!』壁基熬援揚(yáng)壺鎣麴攫200

2、8年5月堅(jiān)型奎些盔蘭墮主堡蘭一染色分析結(jié)果顯示，氮源、碳源、初始培養(yǎng)pH和誘導(dǎo)劑對(duì)Zgallica年4]誘變菌株Z4H12在同等情況下分泌漆酶同工酶的種類和酶帶的強(qiáng)度既有較高相似性，但又存在一定差異，其中SAH12較Zgallica分泌漆酶同工酶的種類更多，條帶強(qiáng)度更高。以麥麩、蛋白胨分別為碳、氮源時(shí)，SAH12分泌漆酶同工酶的種類較其它供試碳、氮源時(shí)相對(duì)較多，最多分別可達(dá)6和13種。且電泳染色條帶較深。在不同初始培養(yǎng)pH條件下，以pH

3、40時(shí)同工酶的數(shù)量相對(duì)較多。誘導(dǎo)荊對(duì)同工酶的合成影響不大。RAPD分析結(jié)果表明，80條隨機(jī)引物中有9條引物(S465，s4，S5，S6，S7，s8，s17S19和s20)的擴(kuò)增產(chǎn)物具多態(tài)性。占1125％。80條引物共擴(kuò)增出253條DNA片斷，其中13條為多態(tài)性片斷，多態(tài)性頻率為51％。由此可見，SAH12與Zgallica的基因組高度同源，但又存在一定的變異，證實(shí)SAH12為zgalliea的突變型。3NativePAGE分析表明，3A

4、H12在高氮低碳高無機(jī)鹽培養(yǎng)液(LM3)中分泌3種漆酶同工酶(Lacl、Lac2和Lae3)。采用硫酸銨鹽析、透析和SephadexG75分子篩層析從其培養(yǎng)液中分離純化得到電泳純的漆酶同工酶Lael。純化倍數(shù)654，酶活性回收597％。Lael經(jīng)DSPAGE驗(yàn)證為單一條帶，其表觀分子量為615kD。Lael為一種糖蛋白，含糖量1160／o，等電點(diǎn)p144，催化底物ABTS氧化的最適反應(yīng)溫度為60“C，最適pH為26，／On值為25umo

5、l／L。Lacl在40“U(pH4OFA下和pHI5～5，o(28“c)范圍內(nèi)穩(wěn)定。金屬離子Fe2、Af、H92、c，和抑制劑DTF、SDS，EDTA、DMSO對(duì)Lael有抑制作用，其中Fe2和DTT完全抑制酶活，而cu2x寸酶有明顯激活作用，M112、Znz對(duì)酶活影響不大。Lael不僅可使一些合成染料明顯脫色，而且對(duì)蘋果汁多酚去除也有很好效果，40“C用該酶(IU／mL)處理蘋果汁5h，其多酚含量可降低40％。4考察了zgallica

6、及其誘變菌株SAH12在麥草粉培養(yǎng)基中固體培養(yǎng)產(chǎn)漆酶和降解麥草纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的能力。結(jié)果表明：SAH12在麥草粉培養(yǎng)基中的漆酶活性產(chǎn)量先是逐漸升高，到第20d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)酶高峰(36015U／Kg)，然后下降，到40d時(shí)降至最低(10472U／Kg)，其后酶活性產(chǎn)量迅速增高，到60d時(shí)達(dá)到143863Uxg。Zgallica產(chǎn)酶的變化趨勢(shì)與BAH12相似，也是先隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增高，然后逐漸下降，再回升，但出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰的時(shí)