產(chǎn)海藻糖合成酶菌株的篩選及其合酶的分離純化和性質(zhì)研究.pdf

1、海藻糖是功能性低聚糖，具有非還原性、保濕性、熱酸穩(wěn)定性、抗凍結(jié)、干燥性等特性，而且它對生物大分子和生物體組織有著非特異性的保護(hù)作用。海藻糖在食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)、化妝品工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。但是海藻糖制取上的困難限制了它的廣泛應(yīng)用。本課題立足從長白山溫泉附近土壤中篩選出產(chǎn)海藻糖合成酶菌株，對其酶解產(chǎn)物進(jìn)行TLC、DNS、HPLC方法綜合使用，快速準(zhǔn)確的篩選得到理想的實(shí)驗(yàn)菌株并且初步鑒定其為芽孢桿菌屬(Bacillus)。研究其培

2、養(yǎng)特性，然后對該菌株所產(chǎn)海藻糖合酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)的研究，通過SDS-PAGE確定其分子量，確定其合酶的全新性。 本課題首先從篩選平板培養(yǎng)基中得到3株菌株，對各菌株分別進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，通過TLC方法定性分析酶解產(chǎn)物得到2株可能產(chǎn)酶菌株，分別命名為SH-110，SH-111，利用兩種不同的顯色劑進(jìn)行顯色，確定其酶解產(chǎn)物中確實(shí)含有非還原糖，再對這兩株菌株利用DNS方法確定所產(chǎn)非還原糖的量，得到產(chǎn)非還原糖量較大SH-110菌

3、株，進(jìn)而對其酶解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC準(zhǔn)確分析產(chǎn)物為海藻糖，測定峰面積，利用外標(biāo)法計(jì)算出海藻糖含量與DNS方法比較，確定DNS方法測得海藻糖含量的準(zhǔn)確性。并把SH-110菌株作為下一步實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株，結(jié)合其個(gè)體形態(tài)特征，菌落形態(tài)特征，革蘭氏染色陽性等特征，并參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《芽孢桿菌屬》菌屬特征，均與短小芽孢桿菌的特征相同，而與其他芽孢桿菌具有明顯差別，因而暫將該菌定名為短小芽孢桿菌一個(gè)菌株(BacilluspumilusSH-1

4、10)。 對實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化研究，采用正交試驗(yàn)方法，確定最佳培養(yǎng)基配方為(％)：1％麥芽糖、0.5％蛋白胨、0.2％牛肉膏、0.1％K2HPO4、0.12％NaH2PO4。利用單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：最佳發(fā)酵溫度為36℃，最佳發(fā)酵pH值為7.2，選取最佳裝液量為150ml，發(fā)酵終點(diǎn)確定為48小時(shí)。 對實(shí)驗(yàn)SH-110菌株所產(chǎn)粗酶液進(jìn)行逐步分離純化，探索一條快速分離純化海藻糖合酶途徑。通過硫酸銨鹽析、凝

5、膠過濾層析、離子交換層析得到酶液純化倍數(shù)10.35，回收率13.8％，通過PAGE電泳確定分離純化達(dá)到了電泳純。通過SDS-PAGE和酶學(xué)性質(zhì)研究確定該酶的全新性。通過SDS-PAGE電泳得到合酶的分子量為62.4KD，海藻糖合酶最適作用溫度為25℃-45℃，最適反應(yīng)溫度35℃。海藻糖合酶在25℃-40℃可以穩(wěn)定保存。海藻糖合酶當(dāng)pH值為7.0時(shí)酶活力最高。金屬離子對酶活性有明顯的作用，Zn2+提高酶活性16％，K+，Na+提高酶活性5