膽紅素氧化酶誘導(dǎo)產(chǎn)生、分離純化及對(duì)染料降解的研究.pdf

1、疣孢漆斑菌代謝產(chǎn)生的胞外膽紅素氧化酶(EC.1.3.3.5)是一種含銅的多酚氧化酶,能氧化膽紅素和多種漆酶底物,在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。本文對(duì)疣孢漆斑菌產(chǎn)膽紅素氧化酶的發(fā)酵條件和胞外膽紅素氧化酶的純化及其對(duì)染料脫色等方面進(jìn)行了研究。
　　 探索疣孢漆斑菌的最佳培養(yǎng)條件為:發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間4天、培養(yǎng)溫度26℃、培養(yǎng)基初始pH6.0、孢子液稀釋度10-3、250mL的三角瓶裝100 mL發(fā)酵液、土豆汁濃度20％時(shí)菌體產(chǎn)酶最佳。采

2、用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,研究培養(yǎng)基中C源、N源、金屬離子及誘導(dǎo)劑對(duì)疣孢漆斑菌產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,葡萄糖和大豆蛋白胨為最適C源和N源,添加2 mmol/L銅離子和0.1 mmol/L的誘導(dǎo)劑均可以提高發(fā)酵液的酶活。正交實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化組合為:葡萄糖10 g/L,大豆蛋白胨7.5 g/L,CuSO41 mmol/L,沒食子酸0.1 mmol/L,優(yōu)化后發(fā)酵液酶活提高了3倍。
　　 經(jīng)過硫酸銨鹽析、透析、DE

3、AE-Sepharose FF離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾等一系列純化步驟從350 mL粗酶液中得到2.43 mg純化的膽紅素氧化酶,最終純化倍數(shù)為3.12,總活力回收率為27.92％。由SDS-PAGE電泳圖片計(jì)算得出純酶的分子量為68.1kDa,Native PAGE電泳圖片是單一條帶,所得的純酶具有較高的純度。Native PAGE電泳中ABTS染色和膽紅素染色說明純酶可以氧化兩種底物,靛紅染色表明純酶可以有效

4、地使染料靛紅脫色。純酶的N端氨基酸序列和飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)的結(jié)果與已報(bào)道疣孢漆斑菌的N端氨基酸序列完全一致,N端氨基酸序列為VAQISPQYPMFTVPL。
　　 純酶用膽紅素為底物測得最適反應(yīng)pH7.5,最適反應(yīng)溫度為40℃;以ABTS為底物最適pH為3.4;純酶25℃時(shí)在pH7.5～8.0的緩沖液中保溫1 h較穩(wěn)定;最適pH下純酶在40℃以下保溫1 h酶活較穩(wěn)定。純化后的膽紅素氧化酶能催化氧化膽紅素和ABT

5、S兩種底物,但對(duì)膽紅素的親和性較好,氧化速度也更快。1 mmol/L半胱氨酸、10 mmol/L的NaN3和1mmol/L二硫疏糖醇對(duì)膽紅素氧化酶活力有強(qiáng)烈的抑制。大多數(shù)金屬離子對(duì)酶反應(yīng)具有抑制作用或影響效果不明顯,但銅離子可以提高酶活力。
　　 共培養(yǎng)體系表明疣孢漆斑菌可以降解多種染料。疣孢漆斑菌對(duì)染料靛紅的降解過程是生物吸附(菌體吸附)和生物降解(酶降解)共同作用的結(jié)果,液體培養(yǎng)7天靛紅的脫色率達(dá)到90％以上。初步純化的膽紅