新月彎孢霉漆酶的產生、分離純化及對染料脫色的研究.pdf

1、本研究從染彎孢菌葉斑病的玉米葉片中分離出一株真菌，經丁香醛連氮法、愈創(chuàng)木酚法和ABTS法聯(lián)合檢測顯示該菌株是一株高產漆酶的菌株。經菌落形態(tài)，孢子形態(tài)等形態(tài)特征并結合ITS1-5.8S-ITS2 rDNA區(qū)域的序列鑒定確認該菌為新月彎孢霉，菌株編號為jqh-100。新月彎孢霉是半知菌類、多孢亞科、彎孢屬的一種真菌，是引起玉米、水稻等禾本科植物病害的重要病原菌之一，也是生產氫化可的松前體物的重要菌種之一，但是關于其產漆酶的研究國內外刊物未見

2、報道。本文在參考其它真菌漆酶研究的基礎上，進一步研究了新月彎孢霉產漆酶的發(fā)酵條件，新月彎孢霉胞外漆酶的純化及其酶學性質，以及新月彎孢霉在染料脫色中的應用。
　　通過單因素實驗、正交實驗及Plackett-burman實驗對產酶條件進行了優(yōu)化，得到新月彎孢霉產漆酶的最適工藝條件為:培養(yǎng)基初始pH6.0，培養(yǎng)溫度35℃，種齡60h，搖床轉速150 rpm/min，250 mL三角瓶中裝入150 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成份為:黃豆芽200

3、g/L煮汁，蔗糖20 g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨3 g/L，硝酸銨1.2 g/L，外加0.05mmol/L CuSO4、MnSO4和MgSO4，吐溫800.2 mL/L，并加0.1 mmol/L愈創(chuàng)木酚作為誘導劑;優(yōu)化后最大酶活力可達2.8 U/mL，約是優(yōu)化前的5倍。酶活高峰出現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)的第72h。
　　通過硫酸銨鹽析，DEAE-Sepharose FF離子交換層析和SephadexG-75凝膠過濾等一系列純化技術，對新月

4、彎孢霉胞外漆酶進行了純化，最終純化倍數(shù)為2.14，總活力回收率為22.76％，由SDS-PAGE電泳圖計算得出純酶的分子量為83.8 kDa。
　　以ABTS作為底物時新月彎孢霉純化后的漆酶的最適反應pH為2.8，米氏常數(shù)為0.069 mmol/L，在pH2.6～3.8維持較高的酶活，超過pH4.0漆酶活性急劇下降;純酶最適反應溫度為30℃。純酶在30℃時在pH4.0～6.4的緩沖液中保溫1h較穩(wěn)定;在最適pH2.8下純酶在40℃

5、以下較穩(wěn)定，超過40℃酶活迅速下降，當溫度升高到60℃時，純酶在1h內完全失去活性。以丁香醛連氮為底物時，純酶的最適反應pH為5.0，米氏常數(shù)為0.149 mmol/L。通過12種金屬離子對漆酶活力的影響研究顯示: Fe2+、Fe3+對酶活有強烈的抑制作用， Cu2+在5 mmol/L對酶活有明顯的促進作用。
　　染料菌體共培養(yǎng)體系和純酶對染料都有較好的脫色效果，共培養(yǎng)體系通過菌體吸附及漆酶降解作用對茜素紅的脫色率達到了90％;純