海洋內(nèi)生擬盤(pán)多毛孢菌J63發(fā)酵產(chǎn)漆酶及漆酶純化和性質(zhì)的研究.pdf

1、漆酶是一種含銅離子的木質(zhì)素降解酶，催化的底物范圍廣泛，有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室從浙江東海20-30米處淤泥中分離得到一株高產(chǎn)漆酶的真菌，鑒定為內(nèi)生擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.），并命名為J63。本文重點(diǎn)考察了該菌株在液體中發(fā)酵產(chǎn)漆酶的特性，并分離純化出其中的一種漆酶同工酶Laccase1，考察了該種漆酶的酶學(xué)特性。
　　首先對(duì)Pestalotiopsis sp.J63菌種發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，重點(diǎn)考察

2、了該菌株利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)漆酶的情況和合適的培養(yǎng)基組成，結(jié)果表明在培養(yǎng)基中加入3 g/L麥芽糖、20 g/L稻草粉和2g/L麩皮并加入0.09 mM苯酚誘導(dǎo)后，可使漆酶酶活達(dá)到了5791.7 U/L。利用Native-PAGE分析漆酶同工酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌種可產(chǎn)生兩種漆酶的同工酶（Laccase1和Laccase2）。誘導(dǎo)劑苯酚、愈創(chuàng)木酚及藜蘆醇不僅能夠加強(qiáng)Laccase1的表達(dá)，而且能夠誘導(dǎo)Laccase2的表達(dá)，從而使酶活得到大幅度提高。

3、無(wú)機(jī)鹽能夠促進(jìn)Pestalotiopsis sp.J63產(chǎn)漆酶，其中H3BO3、SrCl2·6H2O、NaF和KBr均能使酶活提高200％以上。該菌種產(chǎn)漆酶的最適溫度為26℃，最適的產(chǎn)酶pH為6.0。
　　其次，建立了一條從Pestalotiopsis sp.J63發(fā)酵液中分離純化漆酶的技術(shù)路線。通過(guò)絮凝和超濾兩步初級(jí)分離純化，基本去除了發(fā)酵液中離心法無(wú)法去除的懸浮物質(zhì)，并使發(fā)酵液濃縮。然后，選用DEAE Sepharose Fa

4、st Flow進(jìn)行離子交換層析，優(yōu)化后的層析條件為選用pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，流速0.5ml/min，采用階躍方式洗脫。把收集到的DEAE Sepharose Fast Flow洗脫峰中含有漆酶活性的部分，再進(jìn)行Phenyl Sepharose Fast Flow疏水層析，最終的漆酶純化倍數(shù)和回收率分別為14.54和15.27％。經(jīng)SDS-PAGE和Native-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品中為單一的漆酶條帶(Lac

5、case1)。經(jīng)測(cè)定并計(jì)算，該漆酶的相對(duì)分子質(zhì)量為52.4 kDa。
　　第三，測(cè)定了Laccase1的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為60℃，且在60℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好，保溫180 min后仍保留了46.5％的酶活性。最適反應(yīng)pH為3.0，在pH3.5-6的范圍內(nèi)漆酶較穩(wěn)定，36h后仍然能夠保持50％以上的酶活。同時(shí)，考察了12種無(wú)機(jī)鹽對(duì)酶活的影響，除FeSO4·7H2O外其余11種無(wú)機(jī)鹽對(duì)漆酶的酶活沒(méi)有負(fù)影響，ZnSO4·7H2O