桑樹內(nèi)生菌Micrococcusluteus-Y2發(fā)酵產(chǎn)DNJ的研究.pdf

1、1-脫氧野尻霉素（DNJ）是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，能有效抑制糖吸收，降低血糖值。桑根皮在中國古代就被用作治療“消渴癥”的良藥?，F(xiàn)代科學(xué)已經(jīng)證明，桑樹中降血糖的主要有效成分是DNJ。鑒于此，前人已經(jīng)對不同桑品種、桑樹不同部位、不同葉位、不同季節(jié)、不同產(chǎn)地、甚至多種食桑昆蟲的DNJ 含量進行了研究，但是桑樹體內(nèi)DNJ的來源尚未有明確的研究結(jié)果。
　　 目前，從中藥材中提取以及利用植物內(nèi)生菌獲得具有療效的活性物質(zhì)成為藥物研究的重要

2、方向。本實驗室在前期試驗中已經(jīng)從桑樹中分離到兩株產(chǎn)DNJ的內(nèi)生菌：嗜麥芽寡養(yǎng)假單孢桿菌（Stenotrophomonas maltophilia）Y1和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）
　　 Y2。本文對Y2菌株的生理生化指標(biāo)和生物學(xué)特性進行了測定；研究了Y2菌株產(chǎn)DNJ的最佳發(fā)酵條件和發(fā)酵配方，并對發(fā)酵產(chǎn)物進行了初步分離提純；建立了體外α-葡萄糖苷酶抑制活性測定模型，測定了Y1和Y2 發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對α-葡萄

3、糖苷酶的抑制活性。同時，為探討桑樹中的DNJ 來源，本試驗還測定了桑樹無菌苗的DNJ 含量。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.測定了Y2菌株的生理生化指標(biāo)和生物學(xué)特性，結(jié)果表明Y2 與藤黃微球菌的鑒定特征相符。Y2菌株接種后36 h 為對數(shù)生長期,36 h～60 h是生長穩(wěn)定期，60 h后開始衰老；菌株適宜生長的溫度是25℃～35℃，可耐受最低生長溫度為4℃，最高為40℃，最適生長溫度為30℃；該菌株較適宜的pH范圍是6.5～8.0

4、，其中最適宜的pH是7.0，適宜在中性偏堿性條件下生長，并有較強的耐鹽性。
　　 2.通過搖瓶培養(yǎng)方法，探討了環(huán)境條件和培養(yǎng)基組分對Y2菌株產(chǎn)DNJ的影響。
　　 利用單次單因子試驗確定了搖瓶發(fā)酵的最佳條件為：接種量2％（v/v）、搖瓶裝液量50 mL/250 mL、發(fā)酵溫度30℃、初始pH7.0，發(fā)酵時間30 h。
　　 在此基礎(chǔ)上通過單次單因子試驗確定了搖瓶發(fā)酵配方的最佳碳源、氮源、無機鹽組合。運用PB 部分

5、因子試驗分析了培養(yǎng)基組分：蛋白胨、麥芽糖、MgSO4、KH2PO4、NaCl 對Y2菌株產(chǎn)DNJ的影響。結(jié)果表明，蛋白胨對Y2菌株發(fā)酵產(chǎn)DNJ的影響達到極顯著水平，KH2PO4 對Y2菌株發(fā)酵產(chǎn)DNJ的影響達顯著水平，而麥芽糖、MgSO4、NaCl 對Y2菌株發(fā)酵產(chǎn)DNJ的影響不顯著。通過最陡爬坡路徑試驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后用中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析，確定了主要影響因子的最佳濃度。
　　 最優(yōu)化培養(yǎng)基為：麥芽糖20.00 g、

6、蛋白胨36.53G、KH2PO4 2.22 g、MgSO4 0.5 g、NaCl 4 g、去離子水1000 mL。
　　 運用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件進行搖瓶發(fā)酵，利用RP-HPLC-UV法測得發(fā)酵液中DNJ的濃度達到了213.18 μg/ml，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基DNJ 濃度值提高了184.63％。
　　 3.對Y2菌株產(chǎn)生的DNJ 進行了初步分離純化。Y2菌株發(fā)酵樣品進行濃縮后，又經(jīng)過乙醇沉淀、過NKA-9 型大孔吸附樹

7、脂和強酸型離子交換樹脂，最后的樣品經(jīng)過濃縮、冷凍干燥成樣品。提取物衍生化后利用RP-HPLC-UV法對樣品進行檢測，結(jié)果顯示，該純化工藝去除了大量雜質(zhì)，色譜圖中的雜峰大大減少，DNJ 含量達到了0.337％，較之前提高了5.3倍。
　　 4.通過體外α-葡萄糖苷酶抑制模型測定了Y1、Y2菌株發(fā)酵液提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結(jié)果表明：兩種內(nèi)生菌發(fā)酵分離物都具有很強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且最終抑制活性均高于對照藥物阿卡波

8、糖，菌株Y2 發(fā)酵液提取物的抑制中濃度為111.58 mg/L，菌株Y1 發(fā)酵液提取物的抑制中濃度為2307.56 mg/L，分離物的抑制活性均與濃度呈正相關(guān)，其抑制活性具有劑量依賴性。
　　 5.檢測了桑樹無菌苗的DNJ 含量。運用細菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基對桑樹無菌苗內(nèi)的內(nèi)生菌檢測培養(yǎng)，平板中沒有雜菌生長，推斷桑樹組培苗脫毒成功，已無內(nèi)生菌在其體內(nèi)共生。桑樹無菌組培苗干物中DNJ 含量檢測結(jié)果為0.197％，與大田中的桑樹DNJ