東方擬無枝酸菌HCCB10007發(fā)酵組分的研究.pdf

1、萬古霉素是目前臨床上用于治療由MRSA引起的嚴重感染疾病的首選藥物，是國內外研究的熱點。隨著萬古霉素應用和研究的深入，對其有效組分和相關物質的分析鑒定越來越引起關注。國產萬古霉素雖已上市數(shù)年，但其相關物質的研究未見深入報道。隨著萬古霉素耐藥菌的不斷出現(xiàn)，也引發(fā)了人們對萬古霉素持續(xù)有效性的擔心?；谶@種狀況，開發(fā)治療耐藥菌所引起感染的新型糖肽類抗生素勢在必行。 本論文就是試圖建立國產萬古霉素中相關物質的分離純化方法，并對其進行分析

2、、鑒定。同時考察發(fā)酵條件對萬古霉素及相關成分的影響，獲得產物各異的各種發(fā)酵培養(yǎng)基。并對發(fā)現(xiàn)的各種發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化、應用，為糖肽類抗生素的進一步研究奠定基礎。 所取得的主要成果包括： (1)詳細研究了國產萬古霉素中的有關組分，并將其與USP標準品、EP標準品進行類比。通過篩選獲得一種具有特異性吸附作用的弱極性大孔吸附樹脂b，結合中壓液相色譜和高效液相色譜技術，從發(fā)酵液及粗品中分離得到七個組分。通過MS分析，結合文獻報道及

3、有關的化學反應測試鑒定出其中五個組分的化學結構，分別為：去甲萬古霉素，脫氨基萬古霉素B<,1>、B<,2>，單糖萬古霉素，無糖萬古霉素。五個組分均為萬古霉素結構類似物，其中脫氨基萬古霉素B<,1>、B<,2>是一對同分異構體，在溶液中以一定比例共存。另兩個組分的分子量分別為1318D、1459D。并對分離得到的各組分的理化性質及體外活性進行了初步研究：其中無糖萬古霉素的體外活性高于萬古霉素。 (2)考察了東方擬無枝酸菌HCCB1

4、0007在不同發(fā)酵條件，主要是不同氮源培養(yǎng)基下各發(fā)酵產物的變化情況。研究中發(fā)現(xiàn)了萬古霉素及其他組分含量有顯著變化的三種發(fā)酵培養(yǎng)基：萬古霉素效價1200μg·ml<'-1>左右、發(fā)酵液中百分含量高于70％，其他組分含量大幅度降低的合成培養(yǎng)基；組分變化不明顯，但萬古霉素產量提高21％的菌渣酵母培養(yǎng)基；以及發(fā)酵產生無氯萬古霉素的培養(yǎng)基。對前兩種有應用價值的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，為其他相關工作提供了基礎。對無氯萬古霉素進行了分離和結構鑒定，并對其產

5、生條件進行了考察。直接發(fā)酵獲得到的該物質雖然體外活性低于萬古霉素，但有望成為新萬古霉素衍生物的前體物質。 (3)將合成培養(yǎng)基分別應用于東方擬無枝酸菌HCCB10007的基因工程菌HCCB10072、HCCB10081的發(fā)酵驗證中，發(fā)酵結果要優(yōu)于對照培養(yǎng)基，通過發(fā)酵方法得到了萬古霉素的糖苷配基；對茵渣酵母培養(yǎng)基進行了5L發(fā)酵罐的放大實驗，萬古霉素發(fā)酵單位高于對照。并且進行了菌渣酵母的循環(huán)替代實驗，初步研究了萬古霉素菌渣循環(huán)利用的可