抗腫瘤工程菌Nissle1917發(fā)酵工藝優(yōu)化及制劑制備.pdf

1、近年來很多益生菌已成功開發(fā)成保健產(chǎn)品，如益生菌E.coliNissle1917(EcN)、大腸桿菌CFT073(E.coli CFT073)等用來治療腹瀉和維護(hù)腸道。隨著研究的深入細(xì)菌靶向治療腫瘤已成為研究熱點(diǎn)，而益生菌無致病性的特點(diǎn)，使得這些益生菌可以作為藥物載體，口服給藥治療腫瘤。E.coli Nissle1917是一種安全性很高的益生菌株，而經(jīng)過基因修飾的E.coli Nissle1917工程菌EcNVY能夠靶向地傳導(dǎo)抗腫瘤藥物A

2、zurin使得其利用價(jià)值顯著提高。
　　工程菌EcNVY的活菌數(shù)是天清蛋白(Azurin)更高效分泌表達(dá)的首要因素，為獲得產(chǎn)高濃度天清蛋白的抗腫瘤菌劑則需要對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基成分的添加及發(fā)酵條件的篩選得到能夠高產(chǎn)活菌數(shù)的抗腫瘤制劑。本實(shí)驗(yàn)采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了葡萄糖、大豆蛋白、Na2HPO4、 C6H8O7、Na3C6H5O7、乳糖、NaCl、蔗糖8種培養(yǎng)基成分對(duì)抗腫瘤工程菌EcN

3、VY發(fā)酵生物量的影響，通過優(yōu)化從中篩選出了對(duì)工程菌生物量影響顯著的因子葡萄糖、大豆蛋白、磷酸氫鈉。分析結(jié)果顯示這三種物質(zhì)對(duì)工程(EcNVY)活菌生物量高低影響的主次關(guān)系為:Na2HPO4＞葡萄糖＞大豆蛋白。采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以發(fā)酵后工程菌生物量對(duì)數(shù)值為期望值，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析。以菌量對(duì)數(shù)值為期望，獲得了響應(yīng)值與變量之間的二階擬合方程模型，該模型的復(fù)相關(guān)系R2=95.56％，說明該模型的擬合性較高。根據(jù)該模型得到培養(yǎng)基成分為葡

4、萄糖23.26 g/L、磷酸氫鈉8.0 g/L、大豆蛋白12.87 g/L、酵母粉3.00g/L的最佳配方。發(fā)酵后工程菌(EcNVY)的活菌含量可達(dá)到1.66×109cfu·mL-1。
　　發(fā)酵條件在工程菌發(fā)酵中有重要作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)溫度，初始pH，接種量這三個(gè)影響較大的因子進(jìn)行單因素試驗(yàn)，隨后進(jìn)行了Box-Behnken design設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)以工程菌菌量對(duì)數(shù)值為期望，獲得了響應(yīng)值與變量之間的二階擬合方程，該模型的復(fù)合相關(guān)系R

5、2=98.21％，表明該模型擬合性好，根據(jù)該模型可以得到最佳發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度36.50℃、初始pH6.59、接種量3.24％。預(yù)測(cè)最后工程菌EcNVY菌體產(chǎn)量為4.31×109cfu·mL-1。得到最佳發(fā)酵工藝優(yōu)化及制劑制備之后將發(fā)酵液保藏。隨后進(jìn)行腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證抗腫瘤制劑對(duì)小鼠乳腺癌的抑制作用。
　　本文研究了大腸桿菌工程菌EcNVY發(fā)酵工藝。并利用牛奶作為培養(yǎng)基對(duì)工程菌生物量影響顯著的因子進(jìn)行了優(yōu)化，研究了各個(gè)因子對(duì)工程