豬源大腸桿菌Nissle1917株的分離鑒定及其作為口服疫苗載體菌的初步評(píng)估.pdf

1、大腸桿菌Nissle1917是由德國(guó)科學(xué)家Alfred Nissle于1917年發(fā)現(xiàn)的一種益生菌，其血清型為O6∶K5∶H1，它可以在腸道定植，維持腸道菌群平衡，刺激腸道免疫組織產(chǎn)生免疫球蛋白和細(xì)胞因子，對(duì)腸道粘膜免疫具有重要的作用。在國(guó)外Nissle1917已批準(zhǔn)臨床應(yīng)用于人，小鼠和牛，由于對(duì)豬的益生作用還需進(jìn)一步的驗(yàn)證，因此臨床尚未應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)還沒有此方面的任何報(bào)道。
　　 細(xì)菌載體疫苗是將編碼靶抗原或病原體特異性抗原的D

2、NA片段插入減毒病原菌或者共生菌，并在其中有效表達(dá)和向體內(nèi)免疫系統(tǒng)提呈表達(dá)的抗原，有效激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，以期達(dá)到預(yù)防一種或多種疾病的作用。由于作為載體菌的減毒病原菌存在一定的毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，益生菌作為蛋白或抗原的釋放載體成為新的研究亮點(diǎn)。隨著益生菌載體菌蛋白表達(dá)技術(shù)的成熟，大腸桿菌Nissle1917作為口服疫苗安全活菌載體具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在證實(shí)大腸桿菌Nissle1917株作為腸道共生菌存在于豬體內(nèi)，并從豬

3、體內(nèi)分離鑒定出此菌，通過綠色熒光蛋白探索豬源Nissle1917在小鼠體內(nèi)的定植，并檢測(cè)經(jīng)小鼠口服菌體表面表達(dá)粘附素fedF的重組菌Nissle1917-fedF后的免疫應(yīng)答相關(guān)參數(shù)。
　　 Gabriele等依據(jù)人源性大腸桿菌Nissle1917的Ⅰ型菌毛亞單位fimA、F1C菌毛亞單位focA和兩個(gè)質(zhì)粒pMUT1、pMUT2的基因序列設(shè)計(jì)出5對(duì)特異性的PCR引物用于檢測(cè)人源性大腸桿菌Nissle1917，Kleta等用這五對(duì)

4、PCR引物同樣能夠從豬腸道糞便制備的DNA樣品中檢測(cè)到Nissle1917。本試驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)室保存的人源大腸桿菌Nissle1917為陽(yáng)性參考菌株，采集不同品種、不同日齡健康斷奶仔豬的新鮮糞便制備的DNA135份，用上述5對(duì)引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示從其中的兩份DNA樣品中擴(kuò)增出與上述五對(duì)PCR引物預(yù)期大小相符的5個(gè)特異性目的片段，初步認(rèn)為該兩份樣品存在豬源大腸桿菌Nissle1917?；谏鲜鲫?yáng)性假設(shè)，將擴(kuò)增的427bp大

5、小的pMUT2(a)目的片段，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化，T載體連接、克隆、重組質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增，純化回收pMUT2目的片段，用非同位素地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記法制成DNA探針，該探針特異性高，敏感度達(dá)16pg。通過菌落原位雜交的方法從上述兩份陽(yáng)性糞便樣品中分別篩選出2株陽(yáng)性菌落，最后通過血清學(xué)檢驗(yàn)、PCR擴(kuò)增和目的片段的克隆測(cè)序進(jìn)一步鑒定為陽(yáng)性菌株。
　　 構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的重組菌豬源Nissle1917-GFP和表達(dá)F18a

6、b亞單位fedF的重組菌Nissle1917-fedF，重組菌Nissle1917-GFP在紫外燈下可發(fā)出綠色熒光，而Nissle1917-fedF在厭氧條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)可在菌體表面表達(dá)大腸桿菌黏附素F18的亞單位fedF。經(jīng)多次口服免疫ICR小鼠，檢測(cè)重組菌在小鼠體內(nèi)腸道的定植時(shí)間和外周血液樣本中抗fedF特異性IgG水平。檢測(cè)結(jié)果顯示Nissle1917-fedF比Nissle1917-GFP在小鼠腸道內(nèi)的存留時(shí)間長(zhǎng)24h。Nissl