大腸桿菌Nissle1917染色體—質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及功能研究.pdf

1、近年，有關(guān)細(xì)菌靶向治療腫瘤的研究取得了巨大進(jìn)展，但大量的研究工作主要集中在利用活菌本身或其產(chǎn)物使腫瘤局部破壞或引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來(lái)達(dá)到控制、治療腫瘤的目的，因其缺乏特異性和針對(duì)性，且毒副作用大，難以推廣應(yīng)用和臨床研究。非致病性大腸桿菌Nissle1917(O6∶K5∶H1)作為一種益生元在歐洲已經(jīng)獲得治療腸病的認(rèn)證長(zhǎng)達(dá)九十余年，大量的試驗(yàn)、臨床依據(jù)表明，這種細(xì)菌藥物是有效和安全的。有研究表明大腸桿菌Nissle1917對(duì)血清敏感，對(duì)實(shí)體瘤

2、具有偏好性且可在實(shí)體瘤內(nèi)大量增殖，鑒于這一特性，人們嘗試以其為宿主菌構(gòu)建可表達(dá)外源基因藥物的工程菌來(lái)特異性的治療癌癥。但大腸桿菌等宿主菌中重組質(zhì)粒的選擇和維持大多依賴于抗生素及抗生素抗性基因，在工業(yè)、醫(yī)療和食品行業(yè)應(yīng)用中存在生物安全的風(fēng)險(xiǎn)，因此國(guó)際生物技術(shù)研究和管理部門致力于新型非抗生素選擇標(biāo)記方法的研究。目前，能替代抗生素抗性標(biāo)記的主要有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，即所謂的染色體--質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)，原理是構(gòu)建宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變子，再將缺陷基因

3、的正?？截悩?gòu)建于質(zhì)粒載體，通過質(zhì)粒與宿主菌染色體之間的基因互補(bǔ)達(dá)到穩(wěn)定重組質(zhì)粒的目的。
　　 基于以上考慮，本研究利用高效、便利的Red/ET同源重組和位點(diǎn)特異性重組技術(shù)對(duì)大腸桿菌Nissle1917谷氨酰胺合成酶基因(glnA)進(jìn)行敲除，獲得大腸桿菌Nissle1917谷氨酰胺營(yíng)養(yǎng)缺陷株。再克隆全長(zhǎng)的glnA基因，以誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pGB-Ptet-Amp為基礎(chǔ)，采用同源重組替換該質(zhì)粒載體上的氨芐青霉素(Amp)抗性基因，獲得無(wú)

4、抗性篩選標(biāo)記基因的互補(bǔ)質(zhì)粒pGB-Ptet-glnA，通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌Nissle1917 glnA基因缺失突變株，建立起無(wú)抗性標(biāo)記的染色體--質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)。
　　 為深入研究大腸桿菌Nissle1917染色體--質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)的功能，從惡臭假單胞菌Pseudomonas putida KT2440中擴(kuò)增編碼抗癌肽的azurin基因并在N端融合胡蘿卜軟腐歐文氏菌果膠酶pelB基因信號(hào)肽序列，克隆入平衡致死系統(tǒng)的互補(bǔ)表達(dá)