大腸桿菌質(zhì)粒耐藥基因分布及其多態(tài)性研究.pdf

1、目的：
　　 本文主要研究了臨床上最為常見的重要致病菌大腸桿菌的耐藥質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因種類豐度及其多態(tài)性分布。細菌耐藥性的改變,往往與細菌所攜帶的耐藥基因通過各種途徑傳播有關。耐藥基因常位于耐藥菌所攜帶的質(zhì)粒上,可通過質(zhì)?；蛸|(zhì)粒所攜帶的可移動元件在細菌群體中播散。因此,我們通過對來自不同年份大腸桿菌質(zhì)粒DNA序列進行高通量測序,從基因水平研究和分析大腸桿菌質(zhì)粒DNA所攜帶的耐藥基因的種類,數(shù)量以及多態(tài)性分布,為進一步分析大腸桿

2、菌質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因演變規(guī)律和分子進化研究打下基礎。
　　 方法：
　　 本課題以溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床得到320株大腸桿菌作為本實驗菌株來源,其中樣本一2002-2003年160株,樣本二2008-2009年160株。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,并經(jīng)電泳實驗證實,再將全部質(zhì)粒DNA送交深圳華大基因研究院進行solexa測序,將兩個樣本測序得到的短序列通過一系列的生物信息學工具分別與從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫

3、中收集到的耐藥基因序列分別進行比對分析,找出兩個樣本里所包含的耐藥基因類型及豐度的差異,同時找出這些耐藥基因存在的核苷酸多態(tài)位點,分析是否存在新的亞型。
　　 結果：
　　 1.第1個樣本(E1)中的測序結果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為11,077,768,其中可以定位到所收集到的耐藥基因參照序列上的約占1.76％。第2個樣本(E2)中的測序結果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為9,377,792,可以定位到收集到

4、的參照序列上的序列約占1.44％。
　　 2.在兩個樣本的大腸桿菌質(zhì)粒中含有大量的耐藥基因,包括β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類、利福平類和甲氧芐氨嘧啶等9個抗生素抗性家族共計36種耐藥基因型,其中有4種基因型只在E1樣本中出現(xiàn)。
　　 3.兩個樣本所涉及的所有耐藥基因共發(fā)現(xiàn)128個位點存在多態(tài)現(xiàn)象,其中第一個樣本中63個,第二個樣本中65個。同一個位點的A/G二核苷酸多態(tài)是最常

5、見的多態(tài)現(xiàn)象。平行對比兩個樣本的所有耐藥基因,共發(fā)現(xiàn)7個SNP位點,他們分布于5個基因型中,其中有4個是非同義突變,即核苷酸的多態(tài)性引起了氨基酸的變化。
　　 4.在大腸桿菌質(zhì)粒樣本E1中,發(fā)現(xiàn)一個染色體編碼的β-內(nèi)酰胺酶blaKluc成員,分析發(fā)現(xiàn)該酶與Kluc-2在氨基酸水平上有98％的相似性,并且其覆蓋度達到50乘。
　　 5.在E1和E2兩個樣本中,我們均發(fā)現(xiàn)了一個oqxAB基因,該基因于2009年首次被發(fā)現(xiàn)存在

6、于人源的大腸桿菌質(zhì)粒上,在本次收集到的人源大腸桿菌質(zhì)粒中,同樣發(fā)現(xiàn)其存在。
　　 6.tem,strB,strA,flop,aacC2五個基因型始終是兩個臨床細菌樣本中最為流行的抗生素耐藥基因型。
　　 結論：
　　 首先,在方法學上表明新一代高通量測序技術非常適合用來分析多重耐藥細菌的質(zhì)粒基因組的耐藥基因分布及遺傳變異規(guī)律,即便在沒有精確參照序列的情況下,同樣可以檢測和發(fā)現(xiàn)樣本中存在的基因型。同時也表明,一個L