marA基因?qū)喆竽c桿菌多重耐藥的調(diào)控作用.pdf

1、本課題用Red同源重組技術(shù)敲除鴨源大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(O73)多重耐藥調(diào)控基因marA，構(gòu)建marA基因缺失突變株（O73△marA），并采用微量稀釋法測(cè)定5種抗生素對(duì)其的最小抑菌濃度。應(yīng)用熒光定量PCR方法，檢測(cè)O73、O73△marA及其不同藥物誘導(dǎo)時(shí)有關(guān)主動(dòng)外排基因、調(diào)控基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，旨在探討多重耐藥耐性產(chǎn)生及其調(diào)控機(jī)制。
　　利用PCR擴(kuò)增兩翼與目的基因上下游同源、含有卡那霉素抗性基因片段，電擊轉(zhuǎn)化O73/46。

2、在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下，含有質(zhì)粒pKD46的菌株O73表達(dá)λ噬菌體的3個(gè)重組蛋白，在Red同源重組系統(tǒng)表達(dá)重組酶的幫助下，含卡那抗性基因的PCR產(chǎn)物通過(guò)其兩側(cè)的marA基因同源序列與鴨大腸桿菌染色體上的marA基因發(fā)生同源重組，通過(guò)卡那霉素抗性平板篩選得到陽(yáng)性克隆，結(jié)合PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定，證明△marA突變株正確構(gòu)建。還利用PCR分別擴(kuò)增O73marA基因的上下游序列和質(zhì)粒pkD4的卡那抗性基因，分別連接T載體pET-28，再通過(guò)酶切連

3、接的方法分別將marA基因的上、下游連接到pET-28-kan質(zhì)粒上，構(gòu)建同源重組質(zhì)粒PET-28-marA，同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒雙酶切獲得同源重組片段，將同源重組片段電轉(zhuǎn)化至O73中，利用含有同源臂的卡那霉素抗性片段分別替換目的基因marA。測(cè)定O73和O73△marA對(duì)的MIC值。慶大霉素、頭孢噻呋、恩若沙星、多西環(huán)素對(duì)O73△marA的MIC值較O73顯著下降，對(duì)O73的MIC值分別為2、2和4μg/mL，對(duì)O

4、73△marA的MIC值分別為0.125、0.125、0.5μg/mL。
　　慶大霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩若沙星、多西環(huán)素五種藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌株O73和缺失株O73△marA至40代，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)有關(guān)主動(dòng)外排基因和調(diào)節(jié)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明:未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)菌株敲除前與敲除后，acrA,acrB，TolC，acrD，acrE,acrF,soxS，robA基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有所下降介于（0.04～

5、0.74之間）。其中acrD基因的相對(duì)表達(dá)量為0.04，下降最高;而acrE基因的相對(duì)表達(dá)量為0.74，下降最低。O73經(jīng)5種藥物誘導(dǎo)后，其主動(dòng)外排基因mRNA的表達(dá)量大多上升，其相對(duì)表達(dá)量介于0.12～2.73之間。其中，經(jīng)多西環(huán)素誘導(dǎo)至高度耐藥時(shí)，tolC基因的相對(duì)表達(dá)量為2.43，上升2倍。O73經(jīng)頭孢噻呋誘導(dǎo)至高度耐藥時(shí)，acrE基因的相對(duì)表達(dá)量為0.12，下降最高。acrA、acrB、TolC、acrD、acrE、acrF、s

6、oxS、robA基因與未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較，相對(duì)表達(dá)量均未顯著的變化。
　　O73△marA經(jīng)以上藥物誘導(dǎo)后，各主動(dòng)外排基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量介于1.50～55.33之間。O73△marA經(jīng)頭孢噻呋誘導(dǎo)后，acrF基因的相對(duì)表達(dá)量為1.50，上升最低，上升1.5倍;經(jīng)恩若沙星誘導(dǎo)后，tolC基因的相對(duì)表達(dá)量為55.33，上升55倍。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較，敲除株O73△marA誘導(dǎo)后，其主動(dòng)外排基因的表達(dá)量顯著上升。acrA、

7、acrB、TolC、acrD、acrE，acrF、soxS、robA的相對(duì)表達(dá)量較未誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別上升55、20、16、43、16、25、17、19倍，較O73△marA未誘導(dǎo)時(shí)上升251、57、30、464、23、27、72、76倍。O73、O73△marA在慶大霉素誘導(dǎo)前后，8種主動(dòng)外排基因、2種調(diào)控基因mRNA相對(duì)表達(dá)量水平比較:O73誘導(dǎo)到高度耐藥（40代）時(shí)與O73標(biāo)準(zhǔn)菌株接近，O73△marA誘導(dǎo)株(40代)遠(yuǎn)高于未誘導(dǎo)