F18大腸桿菌黏附素菌體表面功能性展呈及其染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、F18大腸桿菌是斷奶仔豬腹瀉(PWD)和仔豬水腫病(ED)的重要病原。該病原菌包括F18ab和F18ac兩種血清型。PWD和ED產(chǎn)生的前提條件是該病原菌首先能定植在易感仔豬小腸上皮細(xì)胞粘膜表面，這個關(guān)鍵過程是由黏附素直接介導(dǎo)的。相關(guān)研究表明F18菌毛的黏附素為菌毛亞單位FedF，F(xiàn)edF受體結(jié)合域位于其分子內(nèi)第60和109位氨基酸殘基之間。運用V型分泌系統(tǒng)MisL，成功地構(gòu)建了在大腸桿菌DH5a菌體表面展示F18大腸桿菌黏附素FedF及

2、黏附素受體結(jié)合域FedFl的載體pnirBMisL-fedF和pnirBMisL-fedFl，經(jīng)厭氧誘導(dǎo)后，與兔抗F18ab菌毛FedF亞單位單因子血清做玻板凝集試驗發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，并且也能較好地黏附于易感仔豬小腸上皮細(xì)胞，而菌體表面展示黏附素FedF突變體FedF(M)(黏附素受體結(jié)合域第88和89位組氨酸殘基雙突變?yōu)楸彼?的重組菌則失去上述凝集和黏附特性。以上研究結(jié)果表明，F(xiàn)18大腸桿菌黏附素FedF及其受體結(jié)合域FedFl在

3、大腸桿菌DH5a菌體表面得到了功能性表達(dá)展呈，也證明了位于FedF受體結(jié)合域內(nèi)第88和89位組氨酸殘基對FedF受體結(jié)合域的形成至關(guān)重要。 為深入研究F18大腸桿菌黏附素在染色體．質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)中的表達(dá)應(yīng)用，采用Red同源重組技術(shù)對大腸桿菌DH5a染色體上asd基因進(jìn)行敲除。首先PCR擴增出兩翼與asdi基因上下游序列同源，中間為氯霉素抗性基因的DNA片段。通過電轉(zhuǎn)化，將外源DNA片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在Red重組酶的幫助

4、下，外源DNA片段與染色體上同源區(qū)域發(fā)生重組，通過氯霉素抗性平板篩選陽性克隆，對篩選得到的陽性克隆再導(dǎo)入編碼Flp位點特異性重組酶的質(zhì)粒pCP20通過第二次重組以去除抗性基因。構(gòu)建成的大腸桿菌DH5a asd基因缺失突變株(DH5α△asd)失去了在普通LB平板上生長的能力，只有補加DAP或者導(dǎo)入表達(dá)asd的質(zhì)粒才能在LB平板上生長。 根據(jù)大腸桿菌K12菌株asd基因兩側(cè)序列設(shè)計一對引物，用PCR的方法擴增出含有啟動子和RBS的

5、DH5a asd全基因，然后將其克隆入上述構(gòu)建好的能菌體表面展示F18大腸桿菌黏附素的載體pnirBMisL-fedF中，使氨芐抗性基因失活的同時表達(dá)asd基因。構(gòu)建成的質(zhì)粒載體pnirBMisL-fedF-asd轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a△asd，兩者在asd功能上形成互補，構(gòu)成了一個染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)。該系統(tǒng)在營養(yǎng)選擇壓力下經(jīng)20次傳代培養(yǎng)沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失，證明了該系統(tǒng)的穩(wěn)定性。間接免疫熒光和仔豬小腸上皮細(xì)胞體外黏附試驗表明該系統(tǒng)在