F18+大腸桿菌鞭毛與其致病相關(guān)性的研究.pdf

1、F18+大腸桿菌病原菌易引起斷奶仔豬的腹瀉、生長遲緩和死亡，從而給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，但遺憾的是至今仍沒有效的疫苗和防治措施。F18+大腸桿菌引起仔豬感染的致病機理，目前認為F18菌毛和毒素是其已知的兩個毒力因子，其中F18菌毛介導其對宿主細胞的黏附，毒素則是通過增加分泌和減少吸收來改變腸細胞的功能而發(fā)揮致病作用。通常認為鞭毛是細菌的運動器官，為細菌提供運動的動力，但近年來的研究陸續(xù)證明其與病原菌的致病力相關(guān)。通過試驗我們發(fā)現(xiàn)F1

2、8ab和F18ac大腸桿菌標準株都具有良好的運動性，而至今有關(guān)F18+大腸桿菌致病機理研究的模型中都未曾提到過鞭毛在其中的作用。本研究以鞭毛為切入點來探討F18+大腸桿菌鞭毛與其致病性之間的關(guān)系。
　　 基于編碼F18+大腸桿菌鞭毛素的fliC基因、編碼F18菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基的fedA基因和編碼鞭毛馬達的motA基因的已知序列，本試驗利用λ噬菌體-Red同源重組系統(tǒng)對F18+大腸桿菌的兩個標準株F18ab(Wild-type，O

3、139∶H1:F18ab，Stx2e)和F18ac(Wild-type，O157∶H19∶F18ac，4P-，STa+，STb+)的上述基因進行敲除。首先將含有fliC，fedA和motA基因同源臂片段和Cat（氯霉素抗性基因）表達盒的PCR擴增產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化至已經(jīng)轉(zhuǎn)化有pKD46質(zhì)粒的F18ab和F18ac大腸桿菌中，在Red同源重組酶的作用下，借助兩端與靶基因兩翼同源的序列與染色體上對應區(qū)域發(fā)生重組，實現(xiàn)一步法構(gòu)建F18ab/ac△f

4、liC∷Cat，F(xiàn)18ab/ac△fedA∷Cat和F18ab/ac△motA∷Cat突變株。在二次重組中利用溫度敏感性、編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，從而消除Cat抗性基因標志。通過PCR鑒定及DNA測序結(jié)果證明了上述缺失株的成功構(gòu)建。在表型試驗中，其fliC缺失株在半固體培養(yǎng)基上缺乏運動性、電鏡下觀察無鞭毛形態(tài)和用WesternBlot檢測不到鞭毛素的表達。motA缺失株細菌表面雖能觀察到鞭毛形態(tài)但在半固體培養(yǎng)基上缺乏運動性。f

5、edA缺失株不能與F18ab單克隆抗體發(fā)生可見的凝集反應。FliC和fedA雙缺失株是在△fliC缺失株的基礎(chǔ)上利用同源重組系統(tǒng)繼續(xù)缺失fedA基因構(gòu)建而成的。該雙缺失株既不能在半固體培養(yǎng)基上運動也不能與F18菌毛的多克隆抗體發(fā)生肉眼可見的凝集反應。fliC、fedA、motA及fliCfedA基因缺失株的成功構(gòu)建，有助于深入研究F18+大腸桿菌的致病機理。
　　 通常，細菌對腸上皮細胞起初的黏附及后續(xù)的定植被認為是腸道疾病發(fā)病

6、機制中關(guān)鍵的第一步。盡管鞭毛介導了多種病原體對宿主細胞的黏附，但還不清楚其是否在F18+大腸桿菌黏附宿主細胞的過程中發(fā)揮作用。本研究通過比較鞭毛缺失株、F18菌毛缺失株、motA缺失株及鞭毛和F18菌毛雙缺失株與野生株對兩個體外仔豬腸上皮細胞，IPEC-1和IPEC-J2細胞的黏附能力發(fā)現(xiàn)，鞭毛缺失株及鞭毛和F18菌毛雙缺失株對上述兩個細胞系的黏附能力都顯著下降(P＜0.05)，而F18菌毛缺失株的黏附能力并無明顯的變化。當把編碼鞭毛馬

7、達的motA基因缺失后構(gòu)建了有鞭毛形態(tài)但不能運動的F18+大腸桿菌菌株，其黏附能力同樣也下降，說明鞭毛介導的運動性在F18+大腸桿菌對宿主細胞的黏附過程中同樣起重要的作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，1:10的多克隆H1或H19抗體分別能抑制隨后F18ab或F18ac大腸桿菌對宿主細胞的黏附，而用間接免疫熒光試驗證明純化的鞭毛也能直接與腸上皮細胞結(jié)合。以上結(jié)果都說明了F18+大腸桿菌鞭毛本身具有黏附特性。另外，通過熒光定量PCR試驗發(fā)現(xiàn)，鞭毛缺失

8、后能使Ⅰ型菌毛的表達量增加了約2倍，F(xiàn)18菌毛及AIDA-Ⅰ分別增加了約1.3和1.4倍，從而揭示了細菌菌體表面的各附屬結(jié)構(gòu)是協(xié)調(diào)表達的。
　　 以上結(jié)果證明了F18+大腸桿菌鞭毛介導了其起初對宿主細胞的黏附。鞭毛在介導黏附時，主要通過兩方面發(fā)揮作用。一方面，鞭毛通過其運動性，非特異性的增加F18+大腸桿菌與宿主細胞之間相互接觸的機率，從而促進黏附。另一方面，鞭毛本身能作為一種黏附素，直接特異性地與宿主細胞上的鞭毛受體結(jié)合而參與

9、黏附。
　　 鞭毛及鞭毛介導的運動性是許多具有侵襲能力的致病菌的重要侵襲因子。通過研究F18abE.coli和F18acE.coli對IPEC-J2和IPEC-1細胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)，和其他的ETEC一樣，F(xiàn)18acE.coli沒有侵襲能力，而F18abE.coli對這兩個細胞都具有侵襲能力。與野生株相比，E.coliF18ab△fliC對IPEC-J2和IPEC-1細胞的侵襲能力都顯著下降。其中fliC缺失后使F18abE.co

10、li對IPEC-J2細胞的侵襲減少了約91％，對IPEC-1細胞的侵襲也減少了約63％。回復株的侵襲能力得到了部分恢復。在37℃時F18abE.coli鞭毛的表達量比在30℃時更多，其侵襲能力也更強。本研究首次發(fā)現(xiàn)了F18abE.coli具有侵襲能力，并證明鞭毛是其重要的侵襲因子。
　　 細菌生物被膜是細菌為了適應不良的生存環(huán)境，而與處于浮游狀態(tài)的單個細菌相對的一種生存方式。大多數(shù)致病菌在一定的條件下都能形成生物被膜。在本研究中

11、我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)18abE.coli和F18acE.coli在體外都具有形成生物被膜的能力，且F18abE.coli形成生物被膜的能力比F18acE.coli強。鞭毛及鞭毛介導的運動性是影響生物被膜形成的重要因素之一。與野生株相比，F(xiàn)18abE.coli鞭毛缺失株在IPEC-J2細胞上只能形成小的微菌落，在試管中形成生物被膜的能力也減弱。而即使是野生型F18acE.coli在IPEC-J2細胞上形成的微菌落也比較少，與此相應的在試管中形成生

12、物被膜能力也較弱。當鞭毛缺失后，其在試管中僅能形成很薄的一層生物被膜。通過生物被膜定量試驗進一步證明，鞭毛缺失后使F18abE.coli和F18acE.coli形成生物被膜的能力都顯著下降。以上結(jié)果說明了鞭毛在F18+E.coli體外生物被膜和微菌落形成中起重要的作用。
　　 單體的細菌鞭毛素蛋白能通過Toll-likereceptor5(TLR5)信號途徑誘導機體促炎性細胞因子IL-8的產(chǎn)生。本研究通過比較F18+E.coli

13、fliC缺失株、fedA缺失株及fliCfedA雙缺失株在體外Caco-2細胞模型中引起IL-8產(chǎn)生的能力發(fā)現(xiàn)，所有的這些缺失株誘導IL-8產(chǎn)生的濃度都下降。FliC缺失株誘導IL-8產(chǎn)生的能力減少了約68％，fedA缺失株減少了約43％，而fliCfedA雙缺失株則減少了約86％。以上結(jié)果說明了鞭毛素蛋白是F18+E.coli在體外誘導誘導IL-8產(chǎn)生的主要因素，也首次證明了F18菌毛在體外也能誘導IL-8的產(chǎn)生。
　　 總之