致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌cya、crp雙基因缺失突變株的構(gòu)建及其相關(guān)功能性分析.pdf

1、鵝卵黃性腹膜炎(俗稱蛋子瘟)，多發(fā)于產(chǎn)蛋高峰期的種鵝群，該病死亡率較高并且可導(dǎo)致種蛋受精率和出雛率下降，它是家禽重要的細(xì)菌性傳染病，病原為禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)，且易與其它病原性細(xì)菌、病毒并發(fā)或混合感染，本病已嚴(yán)重影響到養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。由于APEC血清型眾多，目前尚無(wú)商品化疫苗使用，并且伴隨細(xì)菌耐藥性問(wèn)題的日趨嚴(yán)重，該病的藥物控制越來(lái)越受到嚴(yán)格限制。如何致弱APEC

2、病原菌，獲取免疫原性能好、低或無(wú)毒性的活菌疫苗以有效抵抗APEC病原菌的感染已成為養(yǎng)鵝業(yè)迫在眉睫的問(wèn)題。
　　 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)某些管家基因的缺失會(huì)引起細(xì)菌毒力的減弱，例如cya(adenylate cyclase)、crp(cAMP receptor protein)基因。這兩個(gè)基因分別是編碼合成cAMP的腺苷酸環(huán)化酶以及編碼cAMP的受體蛋白CRP。cAMP與CRP是菌體轉(zhuǎn)運(yùn)和降解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)程中的調(diào)控因子，cAMP受體蛋

3、白CRP也是目前已知的大腸桿菌7個(gè)總調(diào)控蛋白中最為重要的一個(gè)，它調(diào)控了約50％的轉(zhuǎn)錄單位的起始。鑒于cya、crp基因的重要作用，其與致病因子的關(guān)系必然成為近來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。已有報(bào)道國(guó)外學(xué)者已在鼠傷寒沙門氏菌和APEC病原菌O2，O78血清型中成功構(gòu)建cya、crp雙基因缺失株，并在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)缺失株毒力的致弱，且保留了良好的免疫原性。
　　 本實(shí)驗(yàn)基于cya、crp基因的已知序列，利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)對(duì)致鵝卵黃性腹膜炎

4、大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型國(guó)內(nèi)分離株G8107(血清型O2∶K89)、G803(血清型O39∶K89)、G8102(血清型未定)，和大腸桿菌J5(脂多糖突變株)的cya、crp基因進(jìn)行敲除，構(gòu)建△cya△crp雙突變株。其主要構(gòu)建步驟為：首先PCR擴(kuò)增出兩翼與cya基因上下游序列同源，中間為氯霉素抗性基因的DNA片段，然后轉(zhuǎn)化入G8107、G803、G8102和J5，在Red重組系統(tǒng)表達(dá)重組酶的幫助下，含氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物通過(guò)其兩側(cè)的c

5、ya基因同源序列與禽大腸桿菌染色體上的cya基因發(fā)生同源重組，通過(guò)氯霉素抗性平板篩選得到陽(yáng)性克隆，對(duì)篩選得到的陽(yáng)性克隆再導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，通過(guò)第二次重組去除抗性基因，結(jié)合PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定，從而證明△cya突變株G8107△cya、G803△cya、G8102△cya、J5△cya構(gòu)建正確。在成功構(gòu)建△cya突變株的基礎(chǔ)上用相同的方法繼續(xù)構(gòu)建△cya△crp雙基因突變株。
　　 在成功構(gòu)建單突變株△cya與

6、雙突變株△cya△crp缺失株的基礎(chǔ)上，比較分析了野生株和單突變株以及雙突變株在糖酵解、生長(zhǎng)速度、毒力致弱方面的生物學(xué)特性。突變株體外酵解試驗(yàn)表明，與野生株不同，其不能正常利用乳糖、麥芽糖、蔗糖；生長(zhǎng)速度試驗(yàn)表明突變株明顯低于野生株，這是由于細(xì)菌缺少在轉(zhuǎn)運(yùn)和降解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的cya、crp基因，從側(cè)面證實(shí)cya、crp基因的正確缺失。通過(guò)一日齡氣管環(huán)接種雛雞構(gòu)建動(dòng)物模型，檢測(cè)突變株毒力試驗(yàn)，結(jié)果表明6日內(nèi)最高劑量組(3×1

7、09CFU)中野生株、△cya突變株、△cya△crp雙突變株的死亡率分別為60％、20％、0％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了雙突變株毒力較大程度的減弱。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用Red重組系統(tǒng)，成功構(gòu)建了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)血清型分離株G8107、G8102、G803的△cya、△cya△crp突變株，并且證實(shí)了缺失株毒力的致弱?；蛉笔p毒株的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步深入研究禽致病性大腸桿菌管家基因cya、crp與其致病力相互作用的關(guān)系提供