腸炎沙門氏菌鞭毛素fliC基因缺失突變株的構(gòu)建及相關(guān)功能性分析.pdf

1、董立偉：腸炎沙門氏菌鞭毛∥疋基因缺失突變株的構(gòu)建及相關(guān)功能性分析腸炎沙門氏菌鞭毛素f l i C 基因缺失突變株的構(gòu)建及相關(guān)功能性分析專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究生：董立偉導(dǎo)師：朱國(guó)強(qiáng)教授中文摘要腸炎沙門氏菌( S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s , S E ) 是一大類革蘭氏陰性( G - ) 無(wú)芽孢直桿菌，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，為重要的人畜共患病原菌。腸炎沙門氏菌不僅使養(yǎng)禽業(yè)蒙受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還是

2、食源性重要病原菌。誤食腸炎沙門氏菌感染禽蛋及禽肉制品能夠引發(fā)人類的食物中毒，因此其在公共衛(wèi)生學(xué)上也具有重要意義。腸炎沙門氏菌的致病性與其多種毒力因子關(guān)系緊密。通過(guò)不同的致病機(jī)制，腸炎沙門氏菌的毒力因子能夠共同作用于宿主，造成宿主機(jī)體發(fā)病甚至死亡。在這腸炎沙門氏菌的多種毒力因子之中，鞭毛無(wú)疑是不容忽視的一種。沙門氏菌鞭毛作為沙門氏茵的主要運(yùn)動(dòng)器官，功能是輔助其完成有目的性的運(yùn)動(dòng)，典型如化學(xué)趨向性運(yùn)動(dòng)。但近十年來(lái)，沙門氏菌鞭毛與細(xì)菌生物被膜

3、的形成及在誘導(dǎo)宿主機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，尤其是其在致病過(guò)程中對(duì)宿主( 小腸腸道粘膜等) 的粘附定殖作用已逐漸引起了學(xué)術(shù)界的高度關(guān)注。本文以沙門氏茵鞭毛素基因m C 為研究對(duì)象，構(gòu)建腸炎沙門氏菌野生株的鞭毛素／u c 基因缺失株及在S E F l 4 菌毛主要亞單位s e f A 缺失株的基礎(chǔ)上構(gòu)建菌毛鞭毛缺失株，繼而通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)分析比較沙門氏菌鞭毛在腸炎沙門氏菌感染過(guò)程中侵襲、粘附作用及菌毛鞭毛之間可能存在的協(xié)同作用，以期揭示

4、腸炎沙門氏菌與宿主之間相互作用的分子機(jī)制，為腸炎沙門氏菌臨床上的防控提供可靠理論依據(jù)?；诰幋a腸炎沙門氏茵鞭毛素的Ⅳf C 基因的已知序列，本試驗(yàn)利用九噬菌體．R e d 同源重組系統(tǒng)對(duì)腸炎沙門氏茵的國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株C M C C ( B ) 5 0 3 3 6 和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株9 9 4 歷C 基因進(jìn)行敲除。將含有歷C 基因同源臂片段和C a t ( 氯霉素抗性基因) 表達(dá)盒的P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物，將其電轉(zhuǎn)化至已經(jīng)轉(zhuǎn)化含有p K D 4 6 質(zhì)

5、粒的5 0 3 3 6 和9 9 4 腸炎沙門氏菌中，借助R e d 同源重組酶作用，兩端與靶基因兩翼同源的序列可與染色體上相應(yīng)區(qū)域發(fā)生重組，從而一步構(gòu)建5 0 3 3 6 A f l i C ：：C a t 和9 9 4 A f l i C ：：C a t 突變株。二次重組中，利用溫度敏感性編碼F l p 重組酶的質(zhì)粒p C P 2 0 ，消除C a t董立偉：腸炎靶J , “ t - I 氏菌鞭毛∥疋基因缺失突變株的構(gòu)建及相關(guān)功能性

6、分析E s t a b l i s h m e n t o f f l i C D e l e t i o nM u t a n t f r o m S a l m o n e l l aa n d C o r r e s p o n d i n g F u n c t i o nl y s i s o r r e s p o n d i n gu n c t m n A n a i y s i sM ．D ．C a n d i d a

7、 t e ：D o n g L i w e iS u p e r v i s o r ：Z h u G u o q i a n gA b s t r a c tS a l m o n e l l as e r o t y p eE n t e r i t i d i s ( ．∞i s ag r o u po f G r a m n e g a t i v e ( G ‘) b a c i l l u sw h i c hi ss p

8、o r en e g a t i v ea n df l a g e l l a r p o s i t i v e a n dm o t i v e 。I t ’S o n e o f t h em o s t s i g n i f i c a n tz o o n o s i s ．S a l m o n e l l ap r e s e n tah u g et h r e a t t ot h ed e v e l o p m

9、 e n to f b r e e d i n gi n d u s t r y , e s p e c i a l l yp o u l t r yh u s b a n d r y ．A p a r t f r o mt h e h i g hm o r a l i t y i n y o u n gc h i c k e na n dr e t a r d e dg r o w t h i nb r o i l e r ,S a

10、l m o n e l l am a y a l s oc a u s eas e v e r e l yn e g a t i v ei m p a c t o nl a y i n g c h i k e n ，f r o mt h ed r o p o f t h e i rl a y i n g c a p a c i t y t of i n a ld e a t h ．M o r e o v e r , S a l m o

11、n e l l a i s o b v i o u s l y t h em o s ti m p o r t a n t f o o d ·b o r n ep a t h o g e n ．M i s t a k e n i n t a k e o f c h i c k e ne g g s o r o t h e r c h i c k e n p r o d u c t s c o n t a m i n a t e

12、 d b yS a l m o n e l l am a y r e s u l ti nf o o dp o i s o no f h u m a n b e i n g s ，i n d i c a t i n gs i g n i f i c a n c e i np u b l i ch e a l t hi s s u e s ．T h e p a t h o g e n i c i t y o f S a l m o n e

13、 l l a e n t e r i t i d i s i s c l o s e l y r e l a t e dt o m u l t i p l e v i r u l e n c ef a c t o r s ．U n d e r v a r i o u s p a t h o g e n i c m e c h a n i s m s ，d i f f e n e n t S a l m o n e l l ae n t

14、e r i t i d i s v i r u l e n c ef a c t o r sm a yC O - a c t o nt h eh o s t ，c a u s ei l l n e s s o re v e nd e a t ho ft h eh o s t ．A m o n gt h em u l t i p l ev i r u l e n c ef a c t o r s ，f l a g e l l a ri s

15、t h em o s tu n i g n o r a b l e a s t h em a j o rm o t i o no r g a no f S a l m o n e l l a ，p r o v i d i n ga s s i s t a n c e i np u r p o s e d c h e m o t a x i sm o t i o nS Ot h a tb a c t e r i a a r e c a p

16、 a b l eo fg e t t i n ga c c e s s t o n u t r i t i e n t i n t h e o u t e re n v i r o n m e n tw h i l ea v o i d i n gp o t e n t i a l h a r m f u ls u b s t a n c e s ．H o w e v e r , t h e u n k n o w n r e l a

17、t i o n s h i po f S a l m o n e l l af l a g e l l a rw i t ht h ef o r m a t i o no f b i o f i l ma n di t s r o l e i ni n d u c i n g i m m u n o —r e a c t i o na n di n f l a m m a t o r yr e a c t i o n i nh o s

18、tb o d y , e s p e c i a l l yt h em e c h a n i s mo fh o wt h i s k i n d o f b a c t e r i a m a n a g e dt o a t t a c h e d t o t h e i n t e s t i n e m u c o s ah a sa r o u s e dh i g ha t t e n t i o na m o n g

19、a c a d e m i cw o r l d ．T h e r e f o r e ，S a l m o n e l l af l a g e l l a rg e n e f l i Cw a st h o r o u g h l ys t u d i e di n t h i sr e s e a r c hb y e s t a b l i s h i n g f l i Cd e l e t i o nm u t a t i

20、 o n s t r a i no f w i l d t y p e a n db yf u r t h e rd e l e t et h i sg e n e i ns e f A m u t a n t so b t a i n e de a r l i e ri no u rl a b t ob u i l d f l a g e l l a r - f i m b r i ad o u b l em u t a n t so

21、 f S a l m o n e l l a ．T h e ni n v i t r oc e l l t e s t sw e r ec a r r i e do u tt of u r t h e ra n a l y z et h ep o t e n t i a lf u n c t i o no f S a l m o n e l l af l a g e l l ai nt h ep r o c e s s o f a d