利用酵母表面展示技術(shù)對腸炎沙門氏菌FliC蛋白在雞體內(nèi)抗原特性的研究.pdf

1、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis，SE)是一類泛嗜性沙門氏菌，其不僅是危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的病原之一，而且經(jīng)常以污染的家禽產(chǎn)品為載體危害人類健康。由fliC基因編碼的鞭毛蛋白是沙門氏菌重要的保護(hù)性抗原之一，可引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究FliC蛋白的優(yōu)勢抗原區(qū)對沙門氏菌新型疫苗的研發(fā)，進(jìn)而減少人類食源性腸炎沙門氏菌的感染具有重要意義。
　　本研究利用DNaseⅠ將SE的fliC基因隨機(jī)酶切成100-

2、500 bp的DNA小片段，將這些片段插入到酵母表面展示載體pCTCON-2中，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中構(gòu)建酵母隨機(jī)展示文庫pCTCON-fliC-Lib，其庫容量大小約為2.7×105。通過基因測序確定文庫pCTCON-fliC-Lib的隨機(jī)性和插入片段的大小，結(jié)果顯示隨機(jī)挑取的50個(gè)克隆中的所有片段插入方向都是隨機(jī)的，這些片段的大小在100-500 bp范圍內(nèi)，其分布能夠覆蓋整個(gè)fliC基因。
　　將酵母展示文庫pCTCON-fl

3、iC-Lib電擊轉(zhuǎn)入釀酒酵母EBY-100菌株中誘導(dǎo)表達(dá)。用SM6陽性血清染誘導(dǎo)表達(dá)的FliC文庫pCTCON-fliC-Lib，通過流式細(xì)胞儀分選陽性酵母，經(jīng)兩輪分選后，提取陽性酵母的質(zhì)粒進(jìn)行基因測序分析。結(jié)果顯示SM6的FliC蛋白的抗原區(qū)位于D1區(qū)(1-201位氨基酸)、D2區(qū)(202-352位氨基酸)和D4區(qū)(394-505位氨基酸)，非抗原區(qū)位于D3區(qū)(353-393位氨基酸)。
　　將FliC蛋白的4個(gè)區(qū)域進(jìn)行酵母表面

4、展示表達(dá)并通過流式分析4個(gè)區(qū)域的抗原特性;同時(shí)4個(gè)區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)并通過ELISA分析其抗原特性。流式分析和ELISA分析結(jié)果顯示FliC蛋白的4個(gè)區(qū)域中，D1區(qū)和D2區(qū)為主抗原區(qū)，D4區(qū)為次抗原區(qū)，D3區(qū)為非抗原區(qū)。通過雞群免疫FliC蛋白的各個(gè)抗原區(qū)分析各抗原區(qū)在雞體內(nèi)的功能，結(jié)果表明FliC蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、D4區(qū)均能降低SM6在雞體內(nèi)的定植。
　　本研究利用酵母表面展示技術(shù)將構(gòu)建的腸炎沙門氏菌SM6菌株的FliC蛋白抗