禽病原性大腸桿菌E037株有關(guān)基因突變株的構(gòu)建及其致病性研究.pdf

1、禽大腸桿菌病 (Avian Colibacillosis) 是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。禽大腸桿菌病是2至12周齡雞和火雞的一種常見(jiàn)傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)

2、重的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌血清型復(fù)雜多樣，在禽類(lèi)中最常見(jiàn)的血清型是O1、O2和O78，與其致病相關(guān)的毒力因子已被相繼報(bào)道，如脂多糖復(fù)合物、莢膜、黏附素、溫度敏感性血凝素、鐵攝取系統(tǒng)、外膜蛋白、毒素、AGI-3基因組島、侵襲素IbeA、Pst系統(tǒng)、大腸桿菌素等。 雖然已知APEC有許多種毒力因子，但是還未鑒定出某一單獨(dú)的毒力因子可以區(qū)分所有的致病菌株與非致病菌株。人們?cè)谥铝τ谂錋PEC已知毒力因子的同時(shí)，也將注意力轉(zhuǎn)移到新的致病基因

3、的分離與鑒定方面。我們?cè)诖罅壳菰创竽c桿菌的致病性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的分離株并不具備已知的毒力因子，這說(shuō)明這些分離株還存在其他毒力因子，在同一優(yōu)勢(shì)血清型的分離株，其致病性也有高低之分。所以尋找發(fā)現(xiàn)新的大腸桿菌致病因子，具有重要的研究意義。 本研究以構(gòu)建基因突變株的方法，分離和鑒定了 APEC 可能的毒力相關(guān)基因，同時(shí)結(jié)合其生物學(xué)特性，為研究該病的致病機(jī)理和防制措施奠定了基礎(chǔ)。 1．禽病原性大腸桿菌tsh基因突變株的構(gòu)建

4、及其與致病性關(guān)系的研究運(yùn)用基因重組方法將慶大霉素抗性基因(GM)連接到PCR擴(kuò)增的tsh兩端區(qū)域產(chǎn)生的2個(gè)目的基因片段之間，并插入到pUC18載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成帶GM標(biāo)志的載體pUC18-tshFRGM，從中切下此3個(gè)片段，再將之克隆到pMEG-375自殺性載體中，構(gòu)建自殺性載體pMEG375-tshFRGM，將突變載體轉(zhuǎn)化到受體APECE037株和基因缺失突變株E037(Airo)株中，根據(jù)同源重組原理，分別篩選出E037基因

5、缺失突變株E037(Δtsh)和E037(ΔiroAtsh)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明E037(Δiro)、E037(Δtsh)和E037(ΔiroΔtsh)突變株的致病性均有了明顯下降。鐵系統(tǒng)和溫度敏感性血凝素在APEC E037株的致病性和持續(xù)感染中發(fā)揮重要的作用，但兩個(gè)基因的協(xié)同致病能力不明顯。在243株APEC中，有205株為iro<'+>菌株，其中高致病株、中等致病株和低致病株分別為89.8％(184/205)、8.8％(18/205

6、)和1.5％(3/205)；有167株為tsh<'+>菌株，其中高致病株、中等致病株和低致病株分別為87.4％(146/167)、12.6％(21/167)和0％(0/167)。結(jié)果顯示鐵系統(tǒng)和溫度敏感性血凝素為APEC重要的致病因子。 2．禽病原性大腸桿菌兩個(gè)未知基因突變株的構(gòu)建及其對(duì)致病性影響的研究采用抑制差減雜交技術(shù) (Suppression subtractive hybridization，SSH)對(duì)禽病原性大腸桿菌高致病株E

7、037(血清型078)與非致病菌株K-12 MG1655進(jìn)行基因組差異片段克隆與分析。從E037株中共檢出17個(gè)特異性差異片段，選取其中編號(hào)為88＃和126＃的兩個(gè)片段進(jìn)行突變株的構(gòu)建。通過(guò)PCR擴(kuò)增出88＃和126＃2個(gè)目的基因片段，并插入到T-easy 載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建出T-88＃，T-126＃，分別從中切下這兩個(gè)片段，再將之克隆到pMEG-375自殺性載體中，構(gòu)建自殺性載體pMEG375-88＃，DMEG375-126＃將