禽致病性大腸桿菌E058株在雞感染模型中的轉(zhuǎn)錄組學分析及sodA基因功能和致病性評價.pdf

1、致病性大腸桿菌可以分為腸道內(nèi)致病性大腸桿菌(intestinal pathogenic Escherichiacoli)和腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic E.coli，ExPEC)兩類。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)屬于ExPEC中的一種，可以通過呼吸道途徑感染禽類從而引起多系統(tǒng)損傷綜合征。該病給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，已成

2、為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細菌病之一，因此，如何防控該病成為養(yǎng)禽業(yè)面臨的一項艱巨的任務。此外，APEC與引起人類尿道感染的尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)具有很大的相似性，因而APEC目前也被認為是一種食源性的病原菌，具有重要的公共衛(wèi)生意義。
　　DNA芯片是一種穩(wěn)定、實用、可行的全基因組分析方法，能夠探索病原體的分子致病機制，還可以分析細菌病原體在與宿主相互作用時的全局基因表達模式，有助于識別毒力

3、因子及其對應的調(diào)控機制。本研究選取APEC O2血清型代表性菌株E058為模式菌株，利用DNA芯片研究其在感染雞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組學，通過數(shù)據(jù)分析篩選差異表達基因，并對潛在的毒力基因進行研究，擬通過本研究弄清APEC在感染宿主體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄表達譜，并進一步挖掘潛在的毒力基因，為揭示APEC的致病機理提供理論依據(jù)。
　　1.基于DNA芯片分析APEC E058株在感染雞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達譜
　　本研究選擇代表性的APEC分離株E058，

4、感染1日齡無特定病原體（specificpathogenfree，SPF）雞，從感染雞血液中收集菌體，并以E058株在體外LB培養(yǎng)條件下的菌體作對照，以包含UPEC代表性菌株CFT073以及非致病性菌株K12全基因組序列的商品化DNA芯片(Affymetrix GeneChip(R) E.coli Genome2.0 Array)，在全基因組范圍內(nèi)，測定APEC E058株在感染雞體內(nèi)、外基因的表達水平，從而揭示APEC在感染宿主體內(nèi)的

5、基因表達規(guī)律。結(jié)果顯示，APEC E058株在感染雞體內(nèi)表達顯著上調(diào)的基因共有245個，顯著下調(diào)基因共有369個，差異表達基因主要涉及細菌生理代謝、鐵攝取轉(zhuǎn)運、毒力、壓力應激和生物學調(diào)控等方面。根據(jù)基因芯片分析結(jié)果選取了12個差異表達基因（8個上調(diào)和4個下調(diào)基因）經(jīng)熒光定量PCR分析來驗證芯片分析獲得的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明熒光定量PCR確定所選基因的表達水平與基因芯片的結(jié)果一致，由此可以確定基因芯片結(jié)果的可靠性。同時，依據(jù)芯片結(jié)果，篩選APE

6、C E058株在體內(nèi)表達顯著上調(diào)的基因jiY, sodA，phoB和spy，運用基因敲除技術(shù)進行缺失突變，通過比較親本株和突變株對1日齡雛雞的致病力，初步了解和推測所選基因?qū)χ虏⌒苑矫娴挠绊?。結(jié)果顯示，APEC E058的毒力并未因yjiY, phoB和spy基因的缺失而下降，但是sodA缺失后，APECE058對雛雞的致病力顯著下降，表明sodA可能作為潛在的毒力基因參與APEC的致病進程，接下來進一步對sodA基因的功能和致病力進行

7、評價。該研究對于明確目標基因在體內(nèi)的表達水平與其致病作用間的關系，即在體內(nèi)表達水平明顯上調(diào)的基因是否為真正毒力基因提供依據(jù)。
　　2.禽致病性大腸桿菌sodA突變株的構(gòu)建及其致病性研究
　　超氧化物歧化酶SodA作為一種抗氧化應激因子，在細菌抗吞噬細胞的氧化效應中發(fā)揮著重要作用。它對于APEC毒力的直接影響至今還未見報道。本研究旨在研究抗氧化相關基因sodA與APEC致病性之間的關系，為揭示APEC的致病機理及進一步構(gòu)建AP

8、EC弱毒疫苗株奠定基礎。本文運用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建E058ΔsodA基因缺失突變株，之后將帶有相應啟動子的sodA基因完整閱讀框插入到低拷貝質(zhì)粒pACYC184中，通過電轉(zhuǎn)化突變株來篩選獲得回復株。生長曲線的測定結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中，突變株生長速度與野生株E058相似，并未表現(xiàn)出明顯差異，但在含H2O2的LB培養(yǎng)基中，E058ΔsodA突變株的生長速度顯著低于野生株;體外競爭試驗結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中，突變株表現(xiàn)為輕度致弱;血清

9、殺菌試驗表明突變株和野生株對SPF雞血清殺菌作用不敏感;菌株生物被膜檢測結(jié)果顯示突變株的被膜形成能力與野生株相當;體外模擬體內(nèi)環(huán)境應激條件下的細菌存活實驗結(jié)果顯示，突變株對H2O2比較敏感，而對強酸、強堿、高滲透壓、尿素等環(huán)境均不敏感;雞巨噬細胞HD-11細胞吞噬與胞內(nèi)細菌增殖試驗結(jié)果顯示，與野生株相比，突變株E058ΔsodA對HD-11細胞抗吞入和定植能力均下降;半數(shù)致死量實驗結(jié)果顯示，與野生株相比，突變株的致病力下降約100倍;3