禽致病性大腸桿菌中Ⅲ型分泌系統(tǒng)2的分布及其組分EivC功能研究.pdf

1、細(xì)菌通過(guò)分泌系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌胞外或直接注入宿主細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)菌的生存及致病性密切相關(guān)。Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeⅢsecretion system，T3SS）存在于致病性大腸桿菌、沙門菌等細(xì)菌中，與毒力因子的分泌及致病力有關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)EHECO157∶H7存在與沙門菌SPI-1類似的毒力島，將其命名為E.coli TypeⅢsecretion system2(ETT2)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同致病性大腸桿菌中均含有ETT2毒力島。盡管大部分

2、ETT2毒力島存在基因突變和缺失，其在黏附入侵、胞內(nèi)生存、生物被膜形成等方面發(fā)揮重要作用。APEC（Avian pathogenic E.coli，APEC）屬于腸道外致病性大腸桿菌（Extraintestinal PathogenicE.coli，ExPEC），可以引起禽大腸桿菌病，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，APEC與人ExPEC基因組結(jié)構(gòu)相似，具有許多相同的毒力因子和相似的致病機(jī)制。因此，APEC是人ExPEC的毒力基因貯

3、庫(kù)，對(duì)人類健康造成潛在威脅。為了闡明APEC中ETT2的分布及其致病機(jī)制，本研究對(duì)APEC中ETT2進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并分析ETT2ATPase EivC關(guān)鍵活性位點(diǎn)及其對(duì)APEC致病性的影響，為進(jìn)一步研究ETT2在APEC中的致病機(jī)制提供參考。
　　1.ETT2在APEC中的亞型及流行病學(xué)調(diào)查
　　為了檢測(cè)ETT2在APEC中的分布，本研究根據(jù)EHEC O157∶H7的ETT2毒力島序列設(shè)計(jì)8對(duì)重疊PCR引物，檢測(cè)ETT2

4、在APEC臨床分離株中的分布。然后，對(duì)ETT2目的條帶進(jìn)行測(cè)序，分析ETT2亞型。同時(shí)，通過(guò)PCR方法鑒定APEC的血清型、進(jìn)化分群，并分析ETT2與血清型、進(jìn)化分群之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)57.6％(141/245)APEC分離株含有ETT2毒力島。測(cè)序結(jié)果顯示APEC中ETT2分為完整型ETT2（命名為A亞型）和缺失突變型ETT2（命名為B、C、D、E亞型）。血清型分析表明ETT2主要存在于O1、O2和O78血清型APEC中。此外，O

5、78血清型APEC僅含有缺失突變型ETT2，而完整型ETT2主要存在于O1和O2血清型APEC中。分析發(fā)現(xiàn)，T3SS相關(guān)基因簇(eip)僅存在于完整型ETT2陽(yáng)性菌株中。大腸桿菌進(jìn)化分群分析顯示，66.7％(32/48)B1、64.8％(35/54)D、59.6％(31/52)A、44.9％(35/78)B2進(jìn)化分群APEC含有ETT2。然而，ETT2毒力島和其他毒力基因分布沒(méi)有關(guān)聯(lián)性。本研究表明，APEC中ETT2的亞型及分布均顯著高

6、于人的ExPEC，迸一步證明APEC對(duì)人類健康造成潛在威脅。
　　2.ETT2毒力島組分EivC克隆表達(dá)及其ATPase活性分析
　　為了分析APEC ETT2毒力島組分EivC的ATPase活性及其關(guān)鍵活性位點(diǎn)，本研究比對(duì)分析病原菌ATPase序列，分別設(shè)計(jì)克隆表達(dá)引物及點(diǎn)突變引物，然后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后純化相應(yīng)蛋白，并檢測(cè)其ATPase活性。結(jié)果顯示，EivC蛋白包含F(xiàn)0F1ATPase的保守序列Wa

7、lker Box A、Walker Box B及DCCD Box，因此EivC可能屬于ATPase。酶活試驗(yàn)結(jié)果顯示，His-EivC融合蛋白具有ATPase活性，磷酸鹽釋放速率為0.28±0.08mmol/min/mg。根據(jù)病原菌ATPase的關(guān)鍵位點(diǎn)，選擇EivC蛋白第175位賴氨酸、第199位精氨酸、第201位精氨酸、第233位精氨酸進(jìn)行點(diǎn)突變，然而點(diǎn)突變與野生型EivC的ATPase活性無(wú)顯著差異。故本研究表明ETT2毒力島組分

8、EivC為ATPase，但是第175、199、201、233位氨基酸不影響其ATPase活性。
　　3.禽致病性大腸桿菌APCE94eivC基因缺失株、互補(bǔ)株的構(gòu)建及特性分析
　　為了分析ETT2ATPase EivC對(duì)APEC表型和毒力的影響，本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建APCE94的eivC基因缺失株，并利用低拷貝質(zhì)粒pSTV28構(gòu)建eivC基因互補(bǔ)株。然后比較分析野生株、缺失株與互補(bǔ)株的生長(zhǎng)特性、運(yùn)動(dòng)性、抗血清殺菌

9、能力、黏附/侵襲能力、HD-11細(xì)胞內(nèi)存活能力、動(dòng)物致病力等差異。通過(guò)熒光定量方法檢測(cè)APEC鞭毛、菌毛、毒力基因及HD-11細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)水平;并通過(guò)透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌表面形態(tài)變化。結(jié)果顯示，與野生株相比，eivC缺失株的生長(zhǎng)特性無(wú)顯著變化，但其運(yùn)動(dòng)性顯著降低。電鏡檢測(cè)結(jié)果表明eivC缺失株表面的鞭毛減少，而菌毛增加，從而導(dǎo)致細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性降低，熒光定量PCR結(jié)果顯示鞭毛和毒力基因表達(dá)下調(diào)。另外，eivC缺失導(dǎo)致其抗血清殺菌能力