LuxS-Al-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)禽致病性大腸桿菌的調(diào)控研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的傳染病之一。LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌中，可產(chǎn)生用于細(xì)菌種間交流的通用自誘導(dǎo)信號(hào)分子AI-2(Autoinducer-2，AI-2)，在細(xì)菌的許多生理功能中扮演著重要的角色。目前禽致病性大腸桿菌復(fù)雜的血清型和廣譜的耐藥性，給禽大腸桿菌病的防控提出了新的挑戰(zhàn)，該菌LuxS/

2、AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究旨在通過(guò)對(duì)APEC的LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)探究，為防控APEC感染，從細(xì)菌群體角度提供了新的思路，為進(jìn)一步研究密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)APEC的調(diào)控功能和機(jī)理提供參考。
　　1.禽致病性大腸桿菌AI-2的檢測(cè)及其因素分析
　　為探討APEC中是否存在LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)。利用哈維弧菌BB170(vibrio harveyi BB170)對(duì)APEC是否

3、產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明APEC能產(chǎn)生自誘導(dǎo)信號(hào)分子AI-2。
　　為探討禽致病性大腸桿菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同培養(yǎng)條件下，信號(hào)分子AI-2活性與luxS和pfs的轉(zhuǎn)錄水平之間的關(guān)系。本研究利用哈維弧菌BB170檢測(cè)不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同培養(yǎng)條件下APEC的AI-2活性。同時(shí)利用Real-time PCR檢測(cè)APEC不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同培養(yǎng)條件下luxS和pfs的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，APEC在不同生長(zhǎng)時(shí)期的AI-2活性與lu

4、xS的轉(zhuǎn)錄水平保持一致，而與pfs的轉(zhuǎn)錄水平則并不一致。對(duì)影響AI-2活性的因素研究表明，葡萄糖，麥芽糖和NaCl可增強(qiáng)AI-2活性和luxS轉(zhuǎn)錄水平，而蔗糖則下調(diào)AI-2活性和luxS轉(zhuǎn)錄水平。
　　2.禽致病性大腸桿菌AI-2的合成及其對(duì)生物被膜的影響
　　通過(guò)對(duì)APEC的luxS和pfs基因的克隆、表達(dá)和純化，成功獲得了可用于AI-2體外合成的可溶性重組蛋白LuxS和Pfs。
　　利用純化后的LuxS、Pfs與S

5、-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)同時(shí)體外催化作用后，成功獲得濃度為300μmol/L的信號(hào)分子AI-2。
　　為研究AI-2對(duì)APEC生物被膜形成能力的影響。本研究采用改良結(jié)晶紫半定量法和熒光染色法檢測(cè)AI-2對(duì)APEC生物被膜形成能力的影響。結(jié)果表明，AI-2在濃度為0.185mmol/L時(shí)，生物被膜形成能力顯著增強(qiáng)。
　　3.禽致病性大腸桿菌luxS缺失株的構(gòu)建及致病性分析

6、>　　LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌具有重要的調(diào)控作用。為進(jìn)一步研究該系統(tǒng)對(duì)APEC的調(diào)控作用，本研究構(gòu)建了APEC的luxS的缺失株。AI-2活性檢測(cè)結(jié)果顯示，luxS的缺失株喪失產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2的能力。櫻桃谷鴨半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果顯示，luxS基因的敲除使APEC毒力下降31.5倍。對(duì)雞胚層纖維細(xì)胞DF-1細(xì)胞的黏附和入侵試驗(yàn)結(jié)果顯示，luxS基因的敲除使APEC的黏附和入侵的能力，分別下降了50.0％和40.7％。相對(duì)于

7、野生株，luxS的缺失株在體內(nèi)肝臟、脾臟和血液的載菌量分別下降了46.4倍、5.2倍和3.7倍。Real-time PCR結(jié)果顯示，與野生株相比，luxS的缺失株的部分毒力基因（iucD，fyuA，vat，ompA，iss，fimC和tsh）轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P＜0.05)。對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性研究結(jié)果表明，luxS的缺失導(dǎo)致了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性降低。
　　通過(guò)以上研究證實(shí)了APEC存在LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)。APEC在不同生長(zhǎng)時(shí)期的