禽致病性大腸桿菌信號(hào)分子AI-2受體檢測(cè)方法建立及其靶蛋白鑒定.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）可感染雞、鴨、火雞和其他禽類，使宿主出現(xiàn)氣囊炎、蜂窩組織炎、輸卵管炎、腹膜炎等癥狀，是養(yǎng)禽業(yè)最常見的致病菌之一。
　　LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中，可產(chǎn)生種間通用信號(hào)分子 AI-2，并調(diào)控細(xì)菌的多種生理功能。AI-2信號(hào)由胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)需要借助于細(xì)胞的AI-2受體，目前哈維氏弧菌的LuxP型受體和鼠傷

2、寒沙門的LsrB型受體已被證實(shí)存在多種細(xì)菌中。但關(guān)于APEC的AI-2受體，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。
　　本研究旨在通過建立APEC的AI-2受體檢測(cè)方法，運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)，篩選AI-2調(diào)控的靶蛋白，為進(jìn)一步探究LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)在APEC中的調(diào)控通路及鑒定AI-2受體提供參考，從而為從細(xì)菌群體角度防治APEC提供新的思路。
　　1.AI-2受體蛋白檢測(cè)的方法建立
　　為了建立AI-2受體檢測(cè)方法，本研究首先

3、通過基因缺失的方法，構(gòu)建大腸桿菌BL21(DE3)的luxS基因缺失株，成功獲得不能產(chǎn)生AI-2的BL21(DE3)缺失株，并命名為BL21(DE3)?luxS。
　　運(yùn)用pColdTF質(zhì)粒構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌LsrB蛋白的原核表達(dá)載體pColdTF-lsrB，并分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)?luxS和BL21(DE3)中，經(jīng)體外誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得具有生物學(xué)活性的LsrB蛋白。
　　運(yùn)用純化的LsrB對(duì)AI-2分子進(jìn)行了結(jié)合

4、與釋放實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LsrB對(duì)AI-2分子具有結(jié)合能力，且結(jié)合能力是建立在LsrB的活性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上；活性結(jié)構(gòu)喪失后的LsrB不能夠結(jié)合AI-2，并釋放已結(jié)合AI-2。通過建立AI-2受體的檢測(cè)方法，為進(jìn)一步開展APEC的AI-2受體篩選奠定基礎(chǔ)。
　　2.運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選APEC中AI-2的靶蛋白
　　對(duì)APEC內(nèi)化外源性AI-2的動(dòng)力學(xué)研究表明，加入AI-2后第3 h時(shí)，APEC對(duì)AI-2內(nèi)化效率最高（72％）。但

5、運(yùn)用熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，對(duì)APEC內(nèi)化外源性AI-2后luxS、pfs、iss和tsh的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果表明，AI-2內(nèi)化5h時(shí)，上述基因轉(zhuǎn)錄水平變化最顯著（p＜0.001）。上述研究結(jié)果表明從APEC對(duì)AI-2的內(nèi)化和AI-2對(duì)APEC的基因調(diào)控是不同步的。
　　為了研究AI-2對(duì)APEC的靶蛋白的調(diào)控作用，本研究結(jié)合APEC內(nèi)化外源性AI-2的內(nèi)化動(dòng)力學(xué)結(jié)果，選擇AI-2加入APEC中5 h時(shí)的菌體，運(yùn)用非標(biāo)記定量

6、蛋白組學(xué)方法檢測(cè)受AI-2調(diào)控靶蛋白，同時(shí)設(shè)立不加AI-2的APEC對(duì)照組，比較兩者蛋白表達(dá)差異，篩選APEC中受AI-2調(diào)控的靶蛋白。非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示共檢測(cè)到受AI-2調(diào)控的顯著性差異蛋白質(zhì)479個(gè)，對(duì)差異蛋白的生物信息分析結(jié)果表明，受AI-2調(diào)控的靶蛋白主要參與APEC的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　3.AI-2靶基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析
　　對(duì)運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選到的AI-2靶蛋白進(jìn)行分析，選取5個(gè)受A

7、I-2調(diào)控的靶蛋白基因（3630、tufB、phoH、kgtP和yjaE），運(yùn)用Red同源重組的方法，成功獲得上述基因的缺失株。
　　對(duì)構(gòu)建的缺失株進(jìn)行AI-2內(nèi)化檢測(cè)，結(jié)果表明，與野生株相比，上述基因的缺失，并不能顯著影響AI-2的內(nèi)化。本文推測(cè)選取的5個(gè)AI-2靶基因，不是APEC的AI-2受體基因，不參與APEC對(duì)AI-2的內(nèi)化。
　　對(duì)缺失株的LD50檢測(cè)結(jié)果表明，缺失株對(duì)櫻桃谷鴨的致病能力未呈現(xiàn)明顯變化（出現(xiàn)10倍