豬源腸外致病性大腸桿菌六型分泌系統(tǒng)hcp基因缺失株的構(gòu)建及功能研究.pdf

1、Ⅵ型分泌系統(tǒng)(TypeⅥ secretion system)是2006年在霍亂弧菌中被定義的新型分泌系統(tǒng)，其廣泛存在于革蘭氏陰性菌變形菌門中，為15-20個保守結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成的基因簇，主要組分可分為尾鞘、基座，該系統(tǒng)激活后可分泌效應(yīng)因子至靶細(xì)胞體內(nèi)，靶細(xì)胞多為真核細(xì)胞或細(xì)菌，T6SS在許多致病菌中與致病性或細(xì)菌間競爭相關(guān)。溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hemolysin-coregulated protein，Hcp)可形成六聚環(huán)復(fù)合體，由此互相堆疊

2、形成納米管道，構(gòu)成T6SS尾鞘的重要組分，其分泌至胞外常作為T6SS發(fā)揮功能的標(biāo)志。Hcp在T6SS中既作為重要組分，也作為效應(yīng)因子或其分子伴侶發(fā)揮作用。
　　在腸外致病性大腸桿菌中，對T6SS的研究并不多，主要集中在新生兒腦膜炎大腸桿菌RS218和禽致病性大腸桿菌中，T6SS均影響菌株的致病能力。在腸聚集性大腸桿菌中，T6SS主要參與細(xì)菌間競爭過程。許多菌株都含有不止一套的T6SS，或T6SS基因簇中hcp基因存在多個拷貝，通常

3、不同的T6SS基因簇或不同的hcp拷貝在菌體的生物活動中發(fā)揮不同的功能。
　　本實(shí)驗(yàn)室對豬源腸外致病性大腸桿菌PCN033菌株進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)菌株染色體上存在24.6 kbp大小的T6SS基因簇，其中含有2個hcp基因，基因簇外部還有1個hcp，分別命名為hcp1、hcp2、hcp3。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了Δhcp3缺失株，并對其基本生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，制備了Hcp1多克隆抗體，本研究利用同源重組原理構(gòu)建了Δhcp1、Δhcp2

4、、Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株，對其進(jìn)行基本生物學(xué)特性的研究并與親本菌株P(guān)CN033進(jìn)行比較，主要內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　1.豬源腸外致病性大腸桿菌基因缺失株Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3的構(gòu)建參照PCN033全基因組測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，以親本菌株基因組為模板分別擴(kuò)增hcp1、hcp2的上下游同源臂，串聯(lián)構(gòu)建重組的自殺性質(zhì)粒pRE112Δhcp1、pRE112Δhcp2。通過接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入

5、親本菌中，菌體自身的同源重組酶參與同源重組，利用Cm抗性和蔗糖敏感性進(jìn)行正反篩選。先篩選Cm抗性、蔗糖敏感的單交換子，將單交換子于無鹽LB中傳代，再篩選出無Cm抗性、蔗糖耐受的菌株，用檢測引物對菌株進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)出小片段的菌株即為目的缺失株。如此獲得Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3。
　　2.Hcp2、Hcp3多克隆抗體的制備及鑒定參照PCN033全基因組測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，以親本菌株基因組為模板擴(kuò)增hcp

6、2、hcp3基因全長，分別連接于pET30a、pGEX原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化于Ecoli./BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合表達(dá)蛋白Hcp2-His、Hcp3-His。利用鎳離子親和層析柱對蛋白進(jìn)行純化，所得目的蛋白作為免疫蛋白，免疫2月齡日本大耳兔，免疫完成后采取少量血清進(jìn)行Western Blot檢測，確定所制備的血清具有特異性，心臟采血日本大耳兔，收集血清置-80℃?zhèn)溆谩?br>　　3.豬源腸外致病性大腸桿菌hcp家族基因缺

7、失株及親本株細(xì)菌間競爭能力研究將缺失株及親本株為捕食菌，以大腸桿菌K12菌株W3110為被捕食菌，捕食菌與被捕食菌互作后，對存活的W3110計(jì)數(shù)，以W3110的存活率來評價(jià)捕食菌的細(xì)菌間競爭能力。結(jié)果表明，hcp1、hcp2、hcp3全部缺失的菌株，W3110存活率上升最顯著;在3株單缺失菌株中，相對于親本菌株，hcp2缺失后，W3110的存活率顯著上升;hcp1、hcp3缺失后，W3110的存活率略微有上升，但并不顯著。推測在細(xì)菌間競

8、爭過程中，hcp2發(fā)揮主要功能，hcp1、hcp3發(fā)揮輔助協(xié)同作用。
　　4.豬源腸外致病性大腸桿菌hcp家族基因缺失株及親本株致病性研究將缺失株與親本株于37℃，5％ CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞吞噬后存活試驗(yàn)及粘附侵入試驗(yàn)。利用豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)進(jìn)行的吞噬后存活試驗(yàn)表明，hcp家族基因缺失后，吞噬后的存活能力均下降，其中hcp1缺失后下降顯著，三基因缺失株下降最明顯。推測在吞噬后存活過程中，hcp1和hcp3發(fā)揮主要功能，hcp

9、2發(fā)揮輔助協(xié)同作用。利用豬腎細(xì)胞(PK-15)進(jìn)行的粘附侵入試驗(yàn)表明，hcp家族基因缺失后對粘附能力均無顯著影響，hcp1、hcp2缺失后對侵入過程均有影響但不顯著，只有三基因缺失株下降顯著。推測hcp家族基因主要影響菌株的侵入能力而非粘附能力。
　　將缺失株與親本株腹腔分別以107、106、105CFU的劑量接種于4周齡昆明小鼠，記錄小鼠死亡率。結(jié)果顯示，相對于親本株hcp家族基因缺失后，昆明小鼠死亡情況并無明顯改變。將缺失株與