腸外致病性大腸桿菌E044株的質(zhì)粒克隆分析及激活RANTES的分子機制研究.pdf

1、腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli，ExPEC）是一類重要能引起腸道以外器官疾病的病原菌，其特點是攜帶的一些特別的毒力基因使本菌能夠侵入宿主的非消化道器官定植并誘導(dǎo)疾病的產(chǎn)生，腸外致病性大腸桿菌能無臨床癥狀的寄居在宿主消化道，且能與共棲大腸桿菌一同寄居，有時甚至是優(yōu)勢菌株～20％，但不能與腸道致病大腸桿菌菌株一同寄居。一般來說只有共棲大腸桿菌和腸外致病性大腸桿菌能夠

2、引起宿主的腸外疾病。ExPEC感染動物機體后不僅引起腸道外感染，而且會引起機體的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)，激活包括干擾素在內(nèi)的多種細胞因子的表達，同時激活其它一些細胞因子如趨化因子RANTES的表達，從而增加細菌在動物體內(nèi)定殖存活的機率。但ExPEC是通過何種機制來激活RANTES的表達目前尚不清楚，鑒于此，本研究以本實驗室從豬腎中分離的一株血清型為O11的腸外致病性大腸桿菌E044株（ExPEC E044）為研究對象，對其耐藥性、致病性、攜帶

3、質(zhì)粒的特性以及激活RANTES產(chǎn)生的機制進行了初步研究。
　　 具體研究內(nèi)容如下：
　　 1．ExPEC E044株的耐藥性。
　　 用豬場常用的6種不同類型的抗生素和1種不常用的抗生素對ExPEC E044株進行了最小抑菌濃度（MIC）試驗，結(jié)果表明該菌對6種常用的抗生素（阿米卡星、氨芐青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、磺胺嘧啶）均具有很強的抵抗力，特別是對氨芐青霉素的抗性高達2560 ug/mL，而對不

4、常用的頭孢噻肟敏感。
　　 2．ExPEC E044株攜帶質(zhì)粒的分離、測序及對細菌毒力的影響。
　　 從ExPEC E044株中分離到了兩個質(zhì)粒pEC044a（5070bp）和pEC044b（6524bp），測序后通過NCBI網(wǎng)站Blast工具比對核酸序列和ANTHEPROT網(wǎng)站分析蛋白序列發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶有潮霉素抗性基因，潮霉素B激酶基因，四環(huán)素抗性基因，變異表面糖蛋白基因（VSG），鐵傳遞蛋白異二聚體亞單位基因，IgG

5、Fc－binding糖蛋白基因的同源基因。這些同源基因的存在說明本菌所攜帶的質(zhì)?？赡芘c其抗性和毒力相關(guān)，這為進一步研究本菌的致病性打下了基礎(chǔ)。ExPEC E044株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長成單菌落后，放置于4℃ 15天左右所攜帶的質(zhì)粒發(fā)生丟失現(xiàn)象，為檢測質(zhì)粒與細菌毒力的相關(guān)性，將質(zhì)粒丟失前后的菌株分別經(jīng)腹腔接種昆明小鼠，測得質(zhì)粒丟失前后菌株的LD50分別1× 103.92 CFU和1 × 105.36 CFU，相差26倍，質(zhì)粒丟失后菌株

6、的毒力顯著下降。
　　 3．ExPEC E044株激活RANTES的分子機制。
　　 利用RANTES啟動子全長序列的熒光素酶報告質(zhì)粒pCCL5-PGL3證實ExPEC E044菌株感染PK－15細胞后能激活RANTES的表達，為了揭示ExPEC E044激活RANTES表達的分子機制，構(gòu)建了分別缺失RANTES啟動子CRE結(jié)合位點上游序列、CRE、CRE+IRSE及CRE+IRSE+NF－IL6 4種不同突變體的熒光素