華東地區(qū)鴨源禽致病性大腸桿菌系統(tǒng)進化群及毒力相關基因特性分析.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（avian pathogenic Escherichia coli, APEC）能引起禽類的心包炎、肝周炎、腹膜炎、敗血癥等，近年來，腦膜炎型日益增多。APEC血清型多樣，有O血清型176種，K型103種，H型83種，且耐藥性嚴重，存在地區(qū)及品種差異，難以根除，給畜牧業(yè)帶來嚴重危害，同時也是一種人畜共患病病原體,目前APEC的致病機理尚未完全弄清楚。本試驗采用PCR、多重PCR及dot blot等方法對華東地區(qū)APEC

2、鴨源株的系統(tǒng)進化群及所攜帶的毒力相關基因進行了調查，并對分離株DE205B侵襲相關基因ibeA進行序列分析、缺失等。
　　 2005-2007年間，從江蘇、安徽、山東等華東地區(qū)送檢的臨床疑似大腸桿菌感染的病死鴨中，采集病料分離獲得501株細菌。經糖發(fā)酵、尿素酶、IMViC等生化試驗以及三糖鐵瓊脂培養(yǎng)試驗，并經顯色培養(yǎng)基驗證，480株確定為大腸桿菌。表明禽源大腸桿菌病在華東地區(qū)鴨群中廣泛存在，且鴨源APEC變得日益復雜，常見臨床癥

3、狀有心包炎、肝周炎、腹膜炎、關節(jié)炎等，其中有神經癥狀的分離株占74.17％(356/480)；從分離部位看，腦分離株32.08％(154/480)，心臟分離株23.96％(115/480)，肝臟分離株20.21％(97/480)，脾臟、氣囊和腎臟分離株分別為10.83％(52/480),4.79％(23/480)、2.50％(12/480)，其它部位也有分離到，與地區(qū)、種類、宿主等亦有很大相關性。為了揭示其遺傳起源和分子特性，選用一種簡

4、便快速的分子分群方法，即通過擴增chuA和yiaA基因及TspE4.C2DNA片段的三重PCR，對這些分離株進行了系統(tǒng)進化群的分析。在華東地區(qū)分離的480株鴨源APEC菌株中，A群占56.25％,B2群占19.17％,D群占16.46％,B1群占8.13％，對研究我國APEC的生態(tài)分布和遺傳進化具有重要參考價值。
　　 設計并合成16對引物，用PCR及多重PCR方法對鴨源APEC的非侵襲相關的16個毒力基因，包括afa/draB

5、、iha、papC,tsh、mat、chuA、fyuA、irp2、iucD、iutA、iroN、iss、kpsMTII,traT、vat和malX進行檢測，分析其在480株鴨源APEC中的分布。結果表明，在鴨源APEC中，除了kpsMTII全部陰性，其它均有不同程度的分布，即iutA85.83％(412/480),mat83.13％(399/480)、iss83.13％(399/480)、iroN64.38％(309/480)、iucD

6、63.96％(307/480)、tsh52.71％(253/480)、traT47.71％(229/480)、irp232.50％(153/480)、fyuA27.92％(134/480)、chuA27.29％(132/480)、iha6.88％(33/480)、vat3.13％(15/480)、papC1.88％(9/480)、malX1.04％(5/480)、afa/draB0.21％(1/480)；通過比較還發(fā)現16個毒力相關基因

7、在480株鴨源APEC中共存在89種不同的分布模式，含1到13個基因不等，顯示華東地區(qū)鴨源APEC分離株的毒力基因分布較為復雜。
　　 根據已發(fā)表的大腸桿菌侵襲相關基因序列設計并合成11對引物，用PCR及多重PCR方法檢測480株鴨源APEC中11個侵襲相關基因片段的分布，包括fimC、sfa/focCD、cvi/cva、neuC、ompA、cnf1/2、hlyA、gimB、ibeA、yijP和aslA，分析鴨源APEC的侵襲相

8、關基因的分布特征。結果顯示，在鴨源APEC中，除hlyA、cnf1/2和sfa/focCD全部陰性，其它均有不同程度的分布，即yijP9438％（453/480）、ompA9125％(438/480)fimC80.00％(384/480)、cvi/cva67.29％(323/480)、aslA41.25％(198/480)、ibeA3.96％(19/480)、gimB和neuC均為1.67％(8/480)；比較還發(fā)現其存在30種不同的侵

9、襲相關基因的分布模式，含1到7個基因不等，另有一株分離株不含任何侵襲相關基因?？梢夾PEC侵襲相關基因的分布模式的多樣化。
　　 為大批量檢測禽源大腸桿菌病毒力基因，建立了斑點雜交法。將PCR擴增的ibeA的342bp的保守片段DNA測序驗證后標記成地高辛探針，菌液樣品直接在帶正電荷的尼龍膜上裂解，雜交后用CSPD化學發(fā)光法檢測靶基因。特異性試驗表明，該探針僅與靶基因核酸反應。敏感性檢測表明，膜上的最低檢出量為1.0×103個大

10、腸桿菌。PCR檢測的480株鴨源APEC的菌液樣品中，發(fā)現19株為ibeA陽性，用斑點雜交法重復三次檢測上述樣品，陽性率均為3.96％。證明建立的斑點雜交法具有特異、敏感和可重復的特點，可用于大量臨床樣品或菌液直接檢測的初步篩選，尤其對臨床癥狀不明顯的大腸桿菌隱性感染的檢出更具優(yōu)勢。
　　 鴨源APEC分離株DE205B在與新生兒腦膜炎大腸桿菌(Newbornmeningitis-causing Ecoli,NMEC)RS218

11、的系統(tǒng)進化群相同和含有的毒力相關基因相似的前提下，對其進行了溶血反應、致病性試驗和體外感染豬臍靜脈微血管內皮細胞（SUMECs）等相關特性的檢測。結果發(fā)現，DE205B在綿羊血平板上呈β溶血；致病性試驗顯示，具有常見的大腸桿菌病癥狀，對小鼠和鴨的LD50分別為3.97×106和1.05×107CFU/ml。且DE205B能夠在SUMECs上進行生產性復制：瓊脂糖凝膠電泳顯示感染細胞的DNA呈“梯樣”圖譜；光鏡下，可見感染細胞的形態(tài)發(fā)生特

12、征性改變，細胞皺縮，表面微絨毛消失，胞漿內大量空泡出現，細胞核染色體發(fā)生濃縮;流式細胞儀檢測出細胞在感染后出現凋亡；侵襲率為3.36％.
　　 克隆并分析APEC侵襲相關基因ibeA，探尋其變異與進化發(fā)生關系.根據已發(fā)表的NMEC株RS218的ibeA的核苷酸序列，設計合成一對引物，以鴨源APEC神經癥狀腦分離株DE205B基因組DNA為模板，通過PCR技術擴增到ibeA的全基因序列，將檢測正確的基因進行測序。結果顯示DE205

13、B的ibeA序列編碼區(qū)為1371bp，編碼456個氨基酸，分子量為49544.33dal。核苷酸序列比較表明，與已發(fā)表的ibeA基因核苷酸具有較高的同源性（98.9％以上），遺傳進化分析顯示與NMEC親緣關系很近。
　　 將pKD46質粒電擊轉化APEC株DE205B,PCR擴增兩翼與目的基因ibeA同源的卡那霉素抗性基因片段，電擊轉化DE205B/pKD46菌株，借助Red系統(tǒng)的重組功能，置換DE205B基因組中的ibeA基因

14、，并通過導入編碼FLP位點特異性重組酶的質粒pCP20，去除抗性基因標志。對重組菌主要生物學特性的研究表明，ibeA基因缺失株生長能力稍慢于野生株，前6h差別不明顯，711后差別明顯加大；仍可在綿羊血平板上發(fā)生β溶血；對SUMECs的侵襲率降為0.57％；對小鼠的毒力顯著降低，其LD50大于108CFU/ml。用Red系統(tǒng)快速成功的獲得了侵襲相關基因ibeA被完全敲除且不帶卡那霉素抗性基因的大腸桿菌，為深入研究大腸桿菌減毒活疫苗奠定了基