2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩103頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、1目的與意義
   當(dāng)生物體受到外界病原體侵襲時(shí),生物機(jī)體自身會(huì)啟動(dòng)主動(dòng)防御來抵抗侵襲。中性粒細(xì)胞是機(jī)體主動(dòng)防御系統(tǒng)中重要組成部分,具有多種抗微生物活性蛋白和肽類,其中就包括殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/Permeability-increasing Protein, BPI)和防御素(Defensins)。在對(duì)奶牛乳房炎疾病的研究發(fā)現(xiàn),一些β-防御基因在奶牛感染乳房炎時(shí)可在乳腺中誘導(dǎo)表達(dá),說明在患乳房炎時(shí)β-

2、防御素可能在乳腺局部防御中發(fā)揮作用。同時(shí),防御素具有抑制革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria, G')和革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria, G+)的活性,其對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)及大腸桿菌(Escherichia Coli)均有抑制作用。因此其有可能是作為奶牛抗乳房炎的候選基因,在預(yù)防和防治乳房炎方面具有重要的意義。此外,在奶牛的

3、養(yǎng)殖過程中,內(nèi)毒素引起的病發(fā)癥至今仍沒有很有效的治療手段,而BPI有可能在治療內(nèi)毒素病發(fā)癥上發(fā)揮作用。同時(shí),BPI具有特異的抗G-能力,恰好彌補(bǔ)了防御素在抗G-能力上的不足,且BPI和防御素對(duì)細(xì)菌均不易產(chǎn)生耐藥性。鑒于此本試驗(yàn)擬采用基因工程技術(shù),通過構(gòu)建BPI和防御素融合蛋白,以達(dá)整合它們生物活性的目的,使之抗菌譜更廣、抗菌能力更強(qiáng),并以期其能用于更多疾病的治療。除此之外,融合蛋白的構(gòu)建也正好可以解決小分子多肽或蛋白因半衰期較短而容易降

4、解的問題,還可增加基因產(chǎn)物。因此,構(gòu)建BPI和防御素融合表達(dá)載體并表達(dá)其融合蛋白是十分有意義和價(jià)值的。
   2方法與結(jié)果
   (1)本試驗(yàn)以具有臨床乳房炎癥狀的荷斯坦奶牛為試驗(yàn)材料,提取血液白細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank中牛BPI基因序列(序列號(hào):BC102310.1, GI:74354930),設(shè)計(jì)引物,并在引物的5'端引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)。采用RT-PCR技術(shù),巢式PCR的方法擴(kuò)增出BPI基因N-

5、端的cDNA序列,片段大小為714bp。構(gòu)建pEASY-T1-BPI質(zhì)粒,克隆測(cè)序。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示:核酸序列同源性達(dá)99%,氨基酸序列同源性達(dá)100%。根據(jù)GenB ank中牛BNBD4基因序列(序列號(hào):NM_174775.1, GI:28849940),設(shè)計(jì)引物,并在引物的5’端引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出BNBD4基因的cDNA序列,片段大小為192bp。構(gòu)建pBluescript-BNBD4

6、質(zhì)粒,克隆測(cè)序。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示:核酸序列同源性達(dá)100%。
   (2)首先線性化(EcoRⅠ和SalⅠ)空載的pET-28a(+)質(zhì)粒,將BPI基因與其連接,構(gòu)建pET-BPI質(zhì)粒。然后再線性化(HindⅢ和Xho I)pET-BPI質(zhì)粒,將BNBD4基因與其連接,構(gòu)建出pET-BPI-BNBD4融合表達(dá)質(zhì)粒。
   (3)對(duì)含有重組pET-BPI-BNBD4質(zhì)粒的工程菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE顯

7、示37℃下IPTG濃度為1.0mmol/L時(shí),誘導(dǎo)4h時(shí)蛋白表達(dá)量最高,且上清和包涵體中均有大小約為37.3kDa的融合蛋白出現(xiàn),其大小與生物信息軟件ProtParam分析一致。Western blot鑒定結(jié)果顯示在相應(yīng)的位置同樣出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。
   (4)融合蛋白體外抑菌試驗(yàn):瓊脂孔擴(kuò)散法和酶標(biāo)儀檢測(cè)均表明,融合蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出抑制作用。
   3結(jié)論
   本試驗(yàn)成功克隆了牛BPI

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論