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1、該研究從人外周血PMN中提取細胞總RNA;采用RT-PCR方法擴增BPI N端基因片段,將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析;經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化后克隆入pUC19載體;序列分 析表明:所克隆的基因包括信號肽在內(nèi)的BPI活性片段編碼序列,長度為726 bp編碼BPI N端前205個氨基酸;與文獻報道的序列相比,有6個核苷酸差異,推導(dǎo)有4個氨基酸變化,揭示 中國人BPI N端基因可能存在特殊性;基因內(nèi)無終止碼,為開放讀框,含有維持BPI
2、結(jié)構(gòu)與功能所必須的3個半胱氨酸,符合人BPI基因的特征.將重組質(zhì)粒pUC-BPI中的目的基因克隆入 質(zhì)粒pcDNA3構(gòu)建真核表達載體pcDNA-BPI,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細胞進行瞬時表達,表達產(chǎn)物在SDS-PAGE中可顯示一條相對分子質(zhì)量約為25kDa的外源蛋白帶,與預(yù)期的BPI蛋白片段的大小基本一致,Western blot證實,該蛋白帶即為重組表達的BPI.BPI基因的克隆及真核表達取得成功,為獲取大量的BPI重組蛋白,深入研
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