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1、山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文核心蛋白聚糖的基因克隆及其在PichiaPastis中的表達(dá)和活性測(cè)定姓名:郝小夏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):免疫學(xué)指導(dǎo)教師:王桂琴20060520山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractDCNbelongstoamemberoftheexpandinggenefamilyencodingthesecreted,small,leucine—richproteoglycans(SLRPs)thataffectmatri
2、xassemblyandcellularproliferationTheeDNAofDCNexffon,wascomposedof1080bpofnucleotidesandencodedacoreproteinof395aminoacidsObjectives:Toestablishandusetheeukaryotic(PichiaPastoris)expressionsystemforexpressingDCNproteinMet
3、hods:@FulllengthDCNgeneWasamplifiedfromeDNAofDCNextronWasobtainedthroughhumanmusclebyusingsurivinspecificprimersThen,DCNeDNAwasinseaedintopPic9k,andverifiedbysequencing@VerifiedeDNAgenewassubclonedintopPic9kTherecombinan
4、tplasmidwaslinearizedbyrestrictionenzymecuringThelinearDCNgeneWaSintroducedintoHIS/GS115cellsbyLiACThetransformantsweretransferredontoYPDplatesthatcontaineddifferentconcentrationsofG418forselectingthepositiveclonesTheint
5、egratedeDNAinpositivecloneswasconfirmedbyPCR@SelectedtransformantswereculturedinBMMYmediumwith1%methanolforinducingtheexpressionofDCNprotein@AfteraperiodwhenHepG2livercancercelllineweretreatedwithDCNindifferentconcentrat
6、ionsandtime,thesuppressiveeffectofDCNonHepG2livercancercelllineweredetectedbycountingcellResults:①TheresultofsequencinghumaneDNAcomparedwiththeDCNsequenceintheGenBankisthesame②Wehavemadeupaneukaryotic(Pichiapastoris)expr
7、essivevector(pPic9k—DCN)AfterthelinearrecombinantvectorwasintroducedintoHIS一/GSl15cells,wehaveselectedpositiceclonesagainstG418(4mg/m1)andconfirmedbyPCR③DCNproteinreachedhi曲estconcentrationwhenexpressedforonedaysin1%meth
8、anolBMMYmedium@AfteraperiodwhenHepG2livercancercelllineweretreatedwithDCNindifferentconcentrationsandtime,theproliferationofHepG2livercancercelllinewereinhibitedbyDCNrespectivelyshowedcountingcellTheseresultsdemonstrated
9、thathadadosageandtimedependentrelationshipTherewasastatisticallysignificantdecreasedintheproliferationrateamongthethreegroupswithdifferentconcentrations(P005)Conclusions:ToexpressDCNcoreproteininPichiaPastorisispossibleI
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