人肝再生增強(qiáng)因子在pichia pastoris中表達(dá)、純化及活性檢測(cè).pdf

1、目的：建立一套便于純化的肝再生增強(qiáng)因子真核表達(dá)系統(tǒng)，為后續(xù)更好地研究肝再生增強(qiáng)因子的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.用基因重組技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)（ Polymerase chain reaction， PCR）方法，從重組質(zhì)粒pPIC9K-rhALR中擴(kuò)增出編碼rhALR的基因片段。純化后的rhALR基因和pPICZαA空質(zhì)粒，分別經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行DNA連接酶連接，構(gòu)建重組

2、質(zhì)粒pPICZαA-rhALR。
　　2.經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒pPICZαA-rhALR，由限制性?xún)?nèi)切酶SacI單酶切線性化后電轉(zhuǎn)入酵母菌GS115中，在含博來(lái)霉素（Zeocin）的YPD平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，隨后再在含Zeocin濃度遞增的 YPD板上篩選高拷貝子。酵母菌落 PCR鑒定后的高拷貝菌，在1％甲醇誘導(dǎo)下，分泌表達(dá)rhALR。表達(dá)上清蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和Western Blot（ALR多克隆

3、抗體和His-tag標(biāo)簽抗體）鑒定。
　　3.表達(dá)上清經(jīng)鎳柱親和層析純化，再用截留分子量為7kD的透析袋予以透析處理。SDS-PAGE凝膠電泳分析純化效果，BCA試劑測(cè)得目的蛋白濃度。
　　4.MTS試劑檢測(cè)rhALR體外對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2、QGY）的促增殖活性，及其對(duì)順鉑處理的QGY細(xì)胞增殖抑制率影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)rhALR在順鉑（DDP）誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株QGY凋亡時(shí)的抗凋亡作用。
　　結(jié)果：
　　1.成

4、功構(gòu)建rhALR15kD亞型酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZαA-rhALR。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定均與預(yù)期結(jié)果一致。
　　2.成功構(gòu)建 pPICZαA-rhALR GS115真核表達(dá)系統(tǒng)。在含 Zeocin2000μg/ml YPD板中篩出多顆高拷貝菌，菌落PCR鑒定重組菌為Mut+型，即甲醇利用正常型。rhALR被分泌表達(dá)于上清，占上清總表達(dá)蛋白的70%以上，Western Blot均可見(jiàn)單一的分子量約為17.5 kD的

5、條帶。
　　3.SDS-PAGE凝膠電泳分析純化后產(chǎn)物，可見(jiàn)單一的，濃縮的目的蛋白條帶。BCA試劑測(cè)得超濾濃縮后目的蛋白濃度約為（800~1600）μg/ml。
　　4.MTS試劑測(cè)得rhALR對(duì)HepG2細(xì)胞和QGY細(xì)胞的體外促增殖作用呈濃度依賴(lài)性增強(qiáng)，也可濃度依賴(lài)式緩解順鉑處理的QGY細(xì)胞增殖抑制率。而流式細(xì)胞儀檢測(cè)法測(cè)得其對(duì)順鉑誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞亦有呈濃度梯度式的抗凋亡作用。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建能高效分